维吾尔族耳聋肾虚血瘀型与 mtDNA12srRNA基因突变相关性的研究*

李彦华 孙学芬 李惠武 关宏恩 汪常伟 邹广华 亚生江 徐红霞

新疆医科大学附属第四临床医院耳鼻喉科(乌鲁木齐 830000)

世界范围内约有 2.78亿人患有中度以上的听力损失。2006年中国第二次残疾人抽样调查显示:全国残疾人总数高达8000多万,多重残疾中有听力残疾的 776万,言语残疾 127万[1]。耳鸣耳聋严重影响到患者的身心健康,常常导致失眠、疲劳、精神紧张、注意力不集中、情绪消沉,最终影响人的生活质量,包括社交和工作[2]。耳鸣耳聋在维吾尔族发病率比较高,根据导师多年临床经验总结耳鸣耳聋疾病是新疆地区的高发病,而且新疆地区维吾尔族耳鸣耳聋患者中 50%～60%属于肾虚血瘀型,本课题组主要探讨维吾尔族耳聋患者肾虚血瘀型与mtDNA12srRNA基因突变的关系,为基因诊断和治疗提供依据,为耳聋疾病的分型、辩证论治提供理论依据,补充分型指导临床诊治。

1 材料与方法 1.1 研究对象 病例来自于新疆医科大学附属第四临床医院耳鼻喉科病房住院患者及新疆各地州患者,其中符合耳聋诊断标准患者为抽样调查的病例,正常对照组为维吾尔族健康人,不伴有其他疾病。

1.1.1 纳入标准:中医诊断标准[3,4]以听力下降为主要症状,或伴耳鸣及轻度眩晕;常有恼怒、劳累、外感等诱因,或使用了耳毒性药物,或年老体衰、营养不良等因素致病;专科检查时鼓膜无穿孔 ,或无混浊、内陷、增厚、粘连、钙质沉着等表现;纯音听阈测定呈感音神经性聋;应与耳胀、耳闭、耳眩晕、听神经瘤相鉴别。肾虚血瘀证型辨证标准[5]A耳聋,可伴有耳鸣;B耳鸣如蝉或伴腰膝酸软,小便清长,头晕目眩,虚烦失眠,男子遗精,女子白淫,发脱齿摇,舌淡胖大或有齿痕,尺脉沉细或细弱;C口唇、爪甲色暗,舌质暗红或有瘀斑瘀点,脉涩。符合 A+B+C者可辨为肾虚血瘀型。

西医诊断标准:感音神经性耳聋的诊断标准[6,7],多因胚胎发育、遗传因素、孕期因素、娩出损伤及各种后天原因,引起内耳毛细胞、听神经、听通路、听皮层病变。包括先天性感音神经性聋(遗传性聋、非遗传性聋)和后天延迟出现的感音神经性聋,后天非遗传因素包括:感染、耳毒性药物、全身系统疾病引起的耳聋、突聋、中枢性聋等。发病无特殊年龄限制,耳科检查多为正常耳膜及外耳道;听力障碍可为单侧或双侧耳聋听力检查,纯音听阈为感音神经性听力障碍,多表现为高频区听力下降。

1.1.2 排除标准:有与国外种族联姻家族史者;外耳、中耳畸形;可能导致传导性耳聋病史,如有急慢性中耳炎的病史;有中耳或外耳手术史;声导抗测试结果异常;伴有某些全身性疾病者(如:心脏病、糖尿病等);影响听力检测结果的疾病(如:智力障碍者);诊断为进行性耳聋的患者(如:自身免疫性内耳病、梅毒性内耳疾病等 );诊断为耳胀、耳闭、耳眩晕、听神经瘤的患者。

1.1.3 耳聋分度标准:耳聋分度采用国际标准化组织(ISO)、世界卫生组织(W HO)推出类似的耳聋等级标准[6]:轻度聋 26～40dB,中度聋 41～55dB,中重度聋 56～70dB,重度聋 71～90dB,极度聋＞ 91dB。听阈为纯音测听 500、1000、2000、4000Hz的气导听阀平均值。

1.2 病史资料采集 调查采用调查问卷形式,发放“耳聋疾病调查表”,由患者填写有关信息,同时填写知情同意书。调查表内容由基本信息、耳聋史、家族史、出生史、个人史(发病前传染病、耳毒性药物应用情况、头部是否受外伤等)、体检(全身及专科查体)等组成。然后按照纳入、排除标准由两名副高以上中医师 /中西医结合医师进行诊断分型。对全部研究对象由专业检测人员进行纯音听阈、声导抗多频率测听检查。所有符合标准的耳聋患者均抽取外周静脉血 4ml,用以提取基因组DN A,分光光度计进行纯度和浓度鉴定。

2 PCR扩增及测序 2.1 mtDNA12srRNA突变检测测序用引物序列:引物序列 F:5’TGTT TAGACGGGCTCACA TCAC3’;R:5’TT TCATCTT TCCCTTGCGGTAC3’;在mtDNA的位置 648-1601,片段长度 1188bp。

引物由上海生工生物工程有限公司合成,进行常规 PCR,反应条件为 95℃变性 30秒,57℃复性 1min,72℃延伸 7min,共35个循环,反应终止后再 72℃延伸 5min,并用 1.2%琼脂糖凝胶电泳观察条带效果,见图一。电泳图条带符合标准的扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行基因全长测序。

2.2 PCR产物进行直接测序 测序引物与 PCR扩增引物相同,正反双向测序;应用 DN Aman软件分析和判读结果,发现可疑的突变位点后,用 Chromas软件读取测序结果的峰图文件,进行确认或排除。

3 统计学方法 耳聋组突变为 7例(7/137),正常组突变为 0例(0/93),耳聋组的突变均出现在肾虚血瘀型组,即肾虚血瘀型突变为 7例(7/105),非肾虚血瘀型突变为 0例 (0/32),全部数据均采用 SPSS17.0统计学软件进行统计分析,对耳聋组和正常组基因突变的差异性进行 i2检验,得 i2=4.621,P＜0.05,差异有统计学意义,即两组比较有差异。耳聋组肾虚血瘀型与 mtDNA12srRNA基因突变有无相关性进行i2检验,得i2=10.13,P＜0.05,表明两者有统计学意义,即维吾尔族散发感音神经性耳聋肾虚血瘀型与 mtDNA12srRNA基因突变有相关关系。

4 结 果 在 137例耳聋患者中检测到 A1555G位点有4人有突变,突变热点 961delT1例,A827G 1例,nt955ccccnt960 1例,正常组均未见上述突变。测序序列图见下图二至图五,箭头示碱基突变位点及突变峰。

5 讨 论 mtDNA12srRNA基因突变在多种族的家系以及散发病人中均发现该基因突变发生率高,mtDNA A1555G位点突变是与耳聋有关的最常见线粒体突变,一般报道阳性率为 1%～3%[8]。线粒体 DNA的多态位点还显示独特的多态性[9],研究表明,不同 mtDN A单体型可以调节某些疾病的严重性和外显率的表达,如耳聋[10]、衰老[11]和视力损失[12]。本实验中肾虚血瘀型耳聋患者中 mtDN A12srRNA有多种形式的突变,突变热点 A1555G发现 4例 ,发生率为 3.81%(4/105),高于全国平均水平 ,还发现线粒体突变热点 961delT 1例,A827G 1例,nt955ccccnt960 1例,新疆 A1555G突变确有较高的阳性率,实验证明维吾尔族耳鸣耳聋患者肾虚血瘀型与mtDNA12srRNA基因突变有相关关系,李琦对乌鲁木齐特教学校研究显示 A1555G位点汉族阳性率 11.27%,这是迄今为止报道的最高阳性率,mtDN A C1494T突变在新疆耳聋人群中发生频率并不高[13],且维吾尔族未发现该位点突变,和本研究结果一致,证明了该突变在中国耳聋人群中较为罕见。

中医学早已提出肾和耳有着密切的关系,《素问◦阴阳应象大论篇》说:“北方生寒,在脏为肾,在窍为耳”。张大宁多年来对肾的研究,在国内率先提出了“肾虚血瘀论”的概念[14]。张铁英[15]在临床研究中采用中西药合用 ,增加内耳血流量,改善内耳微循环,可使耳聋、耳鸣、眩晕等症状得到改善或消失。徐红霞[16]研究发现肾虚血瘀型可能是导致新疆地区 GJB2基因突变产生差异性的原因之一,具有一定的民族和地域特点。

在本课题组的多年的临床研究中发现耳聋疾病中肾虚血瘀型占有较高的比例,祖国医学认为“肾为先天之本”,先天肾精不足可导致先天性感音神经性聋,后天病后失养,恣情纵欲,多产多育 ,均可耗伤肾精,致子女先天不足 ,导致后天迟发性感音神经性聋,或年老可导致肾精亏虚 ,不能濡养耳窍,致老年性聋,日久累及多个脏腑亏虚,均可引起耳聋;同时维吾尔族以肉食为主 ,饮食习惯偏重于膏粱厚味,冬季漫长,室外体育活动受到限制,加之喜嗜烟酒,极易形成血瘀体质,造成耳窍经脉壅阻,清窍闭塞,发生耳鸣耳聋,肾虚与血瘀是相关并存的,肾虚必兼血瘀,血瘀日久加重肾虚[14]。

综上所述,新疆维吾尔族肾虚血瘀型与 mtDN A 12srRN A基因突变有相关性,该基因突变具有种族特异性,现在医学有学者认为线粒体单倍体型的不同可能引起线粒体基因突变携带率的不同,进而导致不同国家、民族发病率的差异[13],本课题组分析可能与新疆地处欧亚大陆中心,属典型的大陆性干旱气候,独特的地理位置、生态环境、多民族聚集、饮食多肥甘酒炙之品,形成了具有西域特征的疾病,如秽浊痰阻证、西北燥证等,本病为新疆常见病、多发病,具有与内地不同的疾病证型,同时新疆地处中国西北边陲,特殊地区、气候、环境、遗传、饮食等干预因素相对较多,维吾尔族多族内通婚,优生优育工作开展相对困难,尤其在基层医疗水平低,导致耳聋的发病率高。本课题组的研究旨在减少新疆地区维吾尔族人耳鸣耳聋疾病的发生 ,贯彻祖国医学“未病先防,治未病”的理念,并补充完善新疆地区中医的辨证分型,及新疆地区耳鸣耳聋疾病的诊断预防,为耳鸣耳聋的分型论治提供理论依据,进以指导临床,优生优育减少发病率。我们也将近一步深入基因的研究为新疆地区耳聋防治工作做出更大的努力。

[1] 第二次残疾人抽样调查办公室.全国第二次残疾人抽样调查主数据手册[M].北京:华夏出版社,2007,2:38.

[2] DrDavid Jiang.耳鸣及其美国的诊治指导方案 [J].中国听力语言康复杂志,2005,1:58-63.

[3] 国家中医药管理局.中医病诊断疗效标准 [S].南京:南京大学出版社,1994:101-104.

[4] 王士贞,熊大经 ,刘邵武.中医耳鼻咽喉科学 新世纪全国高等中医药院校规划教材 [M].中国中医药出版社,2006,1:82.

[5] 李彦华,邹广华.补肾活血法治疗突发性耳聋 36例疗效观察 [J].新中医,2008,40(12):58-59.

[6] 黄选兆,汪吉宝,种乃川,等.实用耳鼻咽喉科学 [M].北京:人民卫生出版社,2005,10:985-999.

[7] 郑中立.耳鼻咽喉科诊断学 [M].北京:人民卫生出版社,2006,9:231.

[8] 刘 新,戴 朴,黄德亮,等.线粒体 DN A A1555G突变大规模筛查及其预防意义探讨 [J].中华医学杂志,2006,86(19):1318-1322.

[9] 袁永一,李 琦,刘 新,等.与线粒体 12S rRN A 1095T＞C突变相关的遗传性耳聋病因分析 [J].中国听力语言康复科学杂志,2008,3:26-29.

[10] LiX,Fischel-GhodsianN,SchwartzF,etal.Bioche mical characte rizationOf the mitochondrial tRN ASer(UCN)T7511C mutation associated with nonsyndro micdeafness[J].Nucleic Acids Res,2004,32:867-877.

[11] Torroni A,Petrozzi M,DU rbano L,et al.Haplotype and phylogeneticanalyses suggest that one European-specificmtDN A background play sarolein the expression of Leber her editary opticneuro pathy by in creasing the penetrance of the primary mutations11778and14484[J].Am J Hum Genet,1997,60:1107-1121.

[12] Coskun PE,Ruiz-Pesini E,Wallace DC.Control region mtDN Avariants:longevity,climaticadaptation,and aforensic conund rum[J].ProcNatlAcad Sci USA,2003,100:2174-2176.

[13] 李 琦,戴 朴,黄德亮,等.新疆药物性耳聋相关线粒体突变研究 [J].中国听力语言康复科学杂志,2008,5:28-30.

[14] 张大宁.中医补肾活血法研究 [M].中国中医药科技出版社,1997,156-164.

[15] 张铁英,张立刚.滋阴平肝活血法为主治疗突发性耳聋 45例 [J].陕西中医,2007,28(11):1490-1491.

[16] 李彦华,徐红霞,汪常伟,等.维吾尔族遗传性聋非综合征型 GJB2基因突变与肾虚血瘀型的研究 [J].陕西中医,2010,31(1):114-116.