普通烟草WDR基因的克隆与序列分析

雷 波，陈 伟，王茂胜，潘文杰，李继新

（贵州省烟草科学研究所，贵阳550081）

烟草（Nicotiana tobacumL.）茎、叶表面密布腺毛，一般占总表皮毛的85%[1]，烟草腺毛的形态结构与其分泌功能有着密切关系。有研究表明，烟叶表面的腺毛及其分泌物与烟叶香气质和香气量有密切关系，通常腺毛密度高、发育状况好、腺毛分泌物多的烟叶，其香气就浓郁、醇厚和饱满[2-3]。

烟草腺毛是一种多细胞表皮毛，它的形态建成受到一系列转录因子的调控。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，表皮毛的发育机制已得到初步阐明。虽然烟草等植物的表皮毛发育机制与拟南芥不同，但都受到WD40-bHLH-MYB的调控，不同之处是 bHLH和 MYB转录因子不同。因此WD40蛋白是烟草腺毛发育中重要的调控因子之一。WD40蛋白含有约40个氨基酸的保守序列，在大部分生物中含有多个串联WD保守序列，因此也称WD-Repeat蛋白（WDR），主要参与信号传导、细胞周期调控、转录抑制等[4]。目前关于烟草腺毛的研究大部分集中在腺毛密度、形态、化学成分等对烟叶品质的影响方面[5]，分子水平上的研究较少。本研究利用RT-PCR从云烟85中克隆出WDR基因的全长cDNA序列，进行生物信息学分析，为研究WDR基因在烟草中的表达模式、分子进化以及腺毛的形态建成分子机制等打下基础，也有助于不同质量风格特色烟叶形成的发育和分子基础的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 普通烟草栽培品种云烟85。

1.1.2 载体和菌株 大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由本实验室保存。T-载体pMD19-T购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 主要试剂与试剂盒 RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收试剂盒和小量植物组织 RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；DL2000 DNA marker、TaqDNA聚合酶和其它分子生物学试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物合成和DNA测序由上海英骏生物技术公司商业完成。

1.2 方法

1.2.1 烟草叶总RNA的提取 以云烟85幼叶为材料，按照上海华舜生物技术有限公司的小量植物组织RNA抽提试剂盒提供的方法提取总RNA。

1.2.2 烟草叶总 cDNA第一链的获得 以云烟 85幼叶总 RNA样品 1 µg为模版，采用 Oligo dT-Adaptor Primer进行反转录，反转录后产物即为总cDNA第一链。反转录按照TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒说明书略加修改进行。反转录条件为：42℃ 40 min，50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃5min。

1.2.3 烟草WDR（NtWDR）基因的克隆 将矮牵牛（Petunia x hybrida）WD repeat proteinAN11基因（PhAN11）（U94748）cDNA 序列提交到 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站的 expressed sequence tags(EST)和genomic survey sequence(GSS)序列库进行核酸序列比对，得到与PhAN11高度相似的烟草 EST和 GSS序列，采用 Vector NTI Advance 9.0软件进行所获得的EST和GSS序列的多重比对和Contig的拼接。根据多重比对结果，设计 5′和 3′-末端特异引物 FWDR（5′- GAG GGG AGT CAT ATC ATC ACA ATT TTC T-3′）和 RWDR（5′-CAG TAA CTC ACT AAT ACA TTA TCT AAC AC-3′）用于扩增NtWDR全长cDNA序列。

以烟草幼叶cDNA第一链3 µL为模版，采用标准的50 µLTaqPCR反应体系，扩增NtWDR全长cDNA序列。PCR扩增的参数如下：94 °C预变性2 min，35 个扩增循环（94 °C 变性 1 min，58 °C 退火 1 min，72 °C 延伸 2 min），72 °C 保温 10 min。将获得的PCR产物胶回收后，经过T-A克隆，单克隆子PCR检测后，阳性克隆子送样测序。

1.2.4NtWDRcDNA序列的生物信息学分析 序列比对、open reading frame（ORF）查找和翻译、蛋白质基本性质等在Vector NTI Advance 9.0软件上进行。BLAST分析以及蛋白序列的保守结构域搜索在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上进行，蛋白质结构预测在 Expasy（http://www.expasy.org）网站提供的在线分析软件上进行。

2 结 果

2.1 NtWDR cDNA序列的克隆和核苷酸序列基本参数

通过BLASTn分析后共获得烟草WDR基因的12条EST序列，9条GSS序列。采用Vector NTI Advance 9.0软件进行EST和GSS序列多重比对和拼接。BLASTn分析表明该序列与大部分物种WDR基因具有广泛的同源性。可以初步认定其为烟草WDR基因。

以FWDR和RWDR扩增引物，RT-PCR扩增后获得1条约1.4 kb的特异条带，胶回收、T-A克隆和测序。测序结果表明，烟草WDR基因cDNA全长为1 433 bp，命名为NtWDR，Gene Bank登录号为GQ260131。NtWDRcDNA的148-1 176 bp处有1个1 029 bp的开放性阅读框（ORF）（含终止密码子），编码342个氨基酸的蛋白质（图1），Gene Bank登录号为ACT35693。5′非翻译区（UTR）和3′UTR长度分别为147 bp和257 bp，其GC含量分别为40.82% 和37.35%。

2.2 NtWDR蛋白基本参数和可能的翻译后修饰

NtWDR蛋白长度为342氨基酸（aa），分子量（Mw）为38.49 kDa，等电点（pI）为4.81，其中极性氨基酸比例 28.07%，酸性氨基酸比例为13.45%，碱性氨基酸比例为8.48%。含量最丰富的为丝氨酸 Ser，占总氨基酸的 9.18%，其次是 Leu和Ile，为8.23%。NCBI保守域搜索表明，NtWDR蛋白含有 2个交迭保守域 WD40（H78～E294）和COG2319（D77～T297），含有 2 个 WD40 repeats（WDRs），分别位于 K165～D203和 P257～K336，说明所克隆的NtWDR基因是WDR超基因家族成员。

图1 NtWDR cDNA序列和推测的蛋白质序列起始密码子ATG和终止密码子用粗体加下划线表示，氨基酸序列中WD保守域用下划线表示Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequences of NtWDRIn the nucleotide sequence,the start codon ATG and the stop codon are in underlined bold face,the WD domains are underlined

采用 SignalP 3.0[6]、TargetP 1.1[7]和 SOSUI预测NtWDR蛋白无信号肽和信号肽锚定的概率为0或概率极小，因此NtWDR蛋白没有信号肽。NetNGlyc 1.0[8]和PROSITE预测NtWDR蛋白有4个潜在的N-糖基化位点，但糖基化一般发生在信号受体蛋白分子上，而NtWDR蛋白无信号肽，说明在体内这些预测的潜在位点可能不能真正被糖基化。NetPhos 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）[9]预测NtWDR蛋白存在26个磷酸化位点，其潜在Ser、Thr和Tyr活性位点数分别为18、3和5个,NtWDR蛋白存在着丰富的磷酸化位点，说明磷酸化位点修饰对WDR蛋白的功能可能非常重要，也可能是这些磷酸化参与WDR蛋白活性的调控。采用TargetP 1.1预测，NtWDR蛋白亚细胞定位不是叶绿体蛋白或线粒体蛋白，很可能是定位于其他位置，概率达到了 0.841。Softberry-ProtComp 8.0（http://www.softberry.com/）预测结果认为NtWDR蛋白定位于细胞质，预测得分为9.9。WoLFPSORT预测表明，NtWDR蛋白没有核定位信号。采用TMpred[10]、TMHMM[11]和ConPred II软件预测NtWDR蛋白均无跨膜螺旋。

SOPMA预测表明，NtWDR蛋白的二级结构随机卷曲（random coil）所占比例最高，为51.46%，其次是延伸链（extended strand），占34.21%，α螺旋（alpha helix）和β转角（beta turn）所占比例最少，不足10%。SWISS-MODEL和ESyPred3D都未能预测出NtWDR蛋白的三级结构。

2.3 NtWDR基因同源性分析

BLASTn分析表明，NtWDR基因与大部分物种的WD40基因具有广泛的同源性，其中与NtTTG1like protein mRNA（FJ795022.1）同源性最高，在核苷酸水平上一致性达到 94%，其次是番茄（Lycopersicon esculentum）表皮毛克隆到的基因113964R（BT012869），一致性达到86%，与PhAN11基因cDNA一致性为84%，而与AtTTG1基因cDNA一致性为74%。

BLASTp分析表明，NtWDR蛋白与WD40蛋白具有很高的同源性，特别是与AN11/TTG1蛋白具有很高的同源性，其中与 NtTTG1 like Protein（ACN87316.1）具有最高的同源性，一致性达到98%，相似性为 99%。其次是 PhAN11（AAC18914.1），在蛋白质水平上，一致性和相似性分别为92%和95%，而与NtTTG1（ACJ06978）一致性/相似性只有77%/88%。从系统发生（图2）来看，NtWDR首先与NtTTG1 like Protein聚在一起后，与PhAN11聚成一个小类，再与紫苏、葡萄等植物WDR聚在一起，与AtTTG1亲缘关系较远。蛋白质水平多重比对（图3）表明，NtWDR虽然与AtTTG1等亲缘关系较远，但C端及其保守，说明C端与WDR功能密切相关。综合BLASTs、系统进化和蛋白质序列多重比对分析结果，说明NtWDR基因是矮牵牛WDR基因PhAN11和番茄113964R的垂直同源基因。

3 讨 论

TTG1/AN11类型的WD40蛋白在参与所有高等真核生物表皮形成过程中具有广泛的功能[12]，它们与MYB蛋白和bHLH蛋白形成的转录因子复合体是植物界中一个普遍存在的调控途径，参与调控多种细胞的分化和发育途径等[13-14]。TTG1/AN11类型的WD40蛋白在MYB-bHLH-WD40转录因子复合体中为其它转录因子的聚集和互作提供一个基础平台[2]。在拟南芥、矮牵牛、棉花、玉米、紫罗兰等多个植物的研究中表明，TTG1/AN11类型的WD40蛋白在表皮毛的形成、种子表皮及色素的发育起着非常重要的作用[15-17]。

在新基因功能预测中，主要是利用同源基因的功能来推测。同源基因分为垂直同源基因和水平同源基因。垂直同源基因来自不同的物种，起源于同一祖先，其功能在各个物种中相似，水平同源基因是同一基因在相同物种中由于复制而产生的[18-19]。在本研究中，利用RT-PCR方法从普通烟草中克隆得到NtWDR基因的全长cDNA序列，BLASTs分析表明，它与WD40超基因家族有着广泛的同源性。NtWDR基因与Le113964R和PhAN11，在mRNA水平上，一致性分别为86%和84%；蛋白质水平上，一致性/相似性达到了93%/97%和 92%/95%。在蛋白结构上，NtWDR有2个WD40保守区域，在亚细胞定位、信号肽、磷酸化位点、二级结构等方面的预测结果也符合AN11/TTG1类型的WD40蛋白的特征。同源分析和蛋白结构分析进一步证明，NtWDR基因是Le113964R和PhAN11基因的垂直同源基因，推测它们有着相似的功能，即调控表皮毛的发育、花色、种皮色素的合成等功能[20]。普通烟草是异源四倍体植物，通过EST和GSS序列标签以及BLASTs比对发现，NtWDR基因家族成员数可能有2个以上，所克隆的NtWDR基因与NtTTG1like基因高度同源，在cDNA水平上一致性达到94%，在蛋白水平上一致性和相似性达到98%和99%，聚类分析也表明两者同源性最高。因此，NtWDR基因和NtTTG1like基因是水平同源基因。在植物界中，表皮毛的发育受WD40-bHLH-MYB机制调控，在模式植物拟南芥中，目前已鉴定有超过 20个转录因子参与表皮毛的发育调控[21]。金鱼草MIXTA基因（MYB转录因子）和CotMYB基因在烟草中表达能增加烟草表皮毛的数量[22]。烟草腺毛作为一种多细胞的表皮毛，其发育也受到一系列转录因子的调控，其中也包括WDR基因的调控。在烟草腺毛的发育过程中，NtWDR基因的表达是否存在时空和组织特异性，是否受到生态环境的影响，它将如何与MYB和bHLH转录因子互作，进而影响烟草腺毛形态建成的问题还需要进一步研究。

图2 NtWDR和来自其它植物WDR蛋白的系统进化树Fig.2 The phylogenetic tree of NtWDR and other plant WDRs

图3 NtWDR蛋白与其它WDR蛋白多重比对Fig.3 Multi-alignment of NtWDR and other WDR proteins

4 结 论

烟草腺毛的形态结构与其分泌功能有着密切的关系，目前关于烟草腺毛发育的调控基因报道较少。本研究通过 RT-PCR法，从普通烟草云烟 85中克隆到一条腺毛发育的重要调控基因，NtWDR基因的全长 cDNA序列，GeneBank登录号为GQ260131。该基因的克隆为研究烟草腺毛形态建成和不同质量风格特色烟叶形成的发育和分子基础提供了一定的参考价值。

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