甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在烟草及土壤中残留分析方法的研究

曹爱华，孙惠青，徐金丽，徐光军，郑 晓，王秀国，李义强

（农业部烟草类作物质量控制重点开放实验室，烟草病虫害监测与综合治理行业重点开放实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

阿维菌素[1-2]（Avermectins,AVM）是一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生。天然阿维菌素中含有8个组分，主要有4种，即A1a、A2a、B1a和B2a，其总含量≥80%；对应的 4个比例较小的同系物是 A1b、A2b、B1b和B2b，其总含量≤20%。在8个组分中B组分的生物活性优于A组分，其中以B1a组分活性最强，B1b也有一定的杀虫活性。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐[3]（emamectin benzoate，以下简称甲维盐）是农用抗生素阿维菌素B1结构修饰产物，具Bla、Blb两种结构体。目前作为一种新型农畜两用抗生素被广泛应用，可防治蔬菜、果树、棉花、大豆、茶叶、烟草等作物上的鳞翅目、同翅目、鞘翅目和螨类等害虫。其作用机理为增强神经递质如谷氨酸盐和Y-氨基丁酸的作用，从而使大量的氯离子进入神经细胞，使细胞功能丧失，扰乱神经传导，幼虫在接触药剂后很快停止取食，发生不可逆转的麻痹，药剂也可渗透到目标作物的表皮，使药效期延长。目前其检测方法以高效液相色谱法为主，检测器主要以紫外检测器(UVD)[4-7]和荧光检测器(FD)[8-10]为主，二极管阵列(DAD)[11]和紫外分光光度[12]检测也有报道，4种检测器以荧光检测法(FD)灵敏度最高，其次为紫外检测器(UVD)。由于荧光法需柱前衍生，前处理方法较繁琐，故未采用。笔者参考以上几种紫外检测器(UVD)方法，根据烟草中杂峰干扰情况确定了以甲醇/水(88:12，V/V)为流动相[4]，流速为1.0 mL/min；测定波长245 nm的仪器条件检测烟草中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的残留量，方法灵敏度为2.0×10-10g。残留前处理方法也有多种报道：李再兴等[4]采用二氯甲烷萃取以(UVD)检测废水中阿维菌素；李晶等[6]采用甲醇提取，florisil净化的方法检测梨中残留分析；董静等[11]采用乙腈提取ODSC18粉末和PSA粉末净化的方法检测蔬菜中阿维菌素，但未见烟草中的残留分析方法的报道。笔者在参考以上几种方法的基础上，结合烟草特点及甲维盐特性，对烟草中甲维盐的残留分析方法进行了探索和研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪—紫外可变波长检测器（Waters Alliance 2695/2487）、色谱柱Waters Sun Fire(C18,5.0 µm,4.6×150 mm)、回旋式震荡器(HY-5)、旋转蒸发仪(RE-52AA)、SPE净化柱(Florisil-SPE,1g/6mL)。

1.1.2 试剂 丙酮(AR)、甲醇(HPLC)、二氯甲烷(AR)、氯化钠(AR)、无水硫酸钠(AR)、甲维盐标准品(纯度95.5%，德国Dr.E公司)。

1.2 样品处理与分析

1.2.1 样品处理 称取鲜烟叶样品10.0 g（干烟叶4.0 g，土壤20.0 g）于250 mL磨口三角瓶中，加入100 mL丙酮/水（1:1，V/V），回旋式震荡器振荡提取1 h，过滤，取50 mL滤液转入250 mL分液漏斗中，加50 mL 10%氯化钠溶液，分别用50、40和30 mL二氯甲烷萃取3次，萃取液过无水硫酸钠除水，收集于平底烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压浓缩至近干，土壤样品用2 mL甲醇溶解，过0.45 µm滤膜，待测定。烟叶样品用2 mL二氯甲烷溶解，待净化。净化用Florisil-SPE柱，5 mL二氯甲烷预淋洗，将上述2 mL甲醇溶解液转入柱中，用10 mL二氯甲烷分数次淋洗，弃去淋出液。用20 mL丙酮/二氯甲烷(6:4，V/V)淋洗SPE柱，收集淋出液。旋转蒸发仪减压浓缩至近干，用2 mL甲醇定容，待测定。

1.2.2 色谱条件 流动相：甲醇/水（88:12，V/V），经 0.45 µm 滤膜过滤；并进行脱气；流速：1.0 mL/min；测定波长：245 nm；柱温：30℃；进样量：10 µL

1.2.3 保留时间 甲维盐在上述检测条件下的相对保留时间为：B1b 5.9～6.4 min，B1a 7.1～7.2 min。

2 结 果

2.1 标准曲线的绘制

用甲醇配制100 mg/L的甲维盐标准品母液，稀释浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L的标准曲线工作液，以甲维盐进样浓度(mg/L)为横坐标，对应高效液相色谱测定峰面积(µv)为纵坐标绘制标准曲线，其一元线性回归方程为：

相关系数r= 0.99717(B1a)、r= 0.99678(B1b)（图1）。

图1 甲维盐标准曲线Fig.1 emamectin benzoate B1b and B1a Standard curve

2.2 最小检出量和最低检出浓度

在以上仪器条件下最小检出量为：2.0×10-10g(B1a)；1.0×10-9g(B1b)。方法最低检出浓度B1a：鲜烟叶0.002 mg/kg，干烟叶0.005 mg/kg，土壤0.001 mg/kg；B1b：鲜烟叶0.01 mg/kg，干烟叶0.02 mg/kg，土壤0.005 mg/kg。

2.3 添加回收率与相对标准偏差

甲维盐为B1a、B1b的混合物，在样品测定时，残留量为2种结构体含量之和。以鲜烟叶（图3）、干烟叶、土壤（图4）对照样品，分别添加3个不同浓度的甲维盐标准品溶液（图3、4），每个浓度做5个平行样，按上述方法提取、净化和检测。结果表明，甲维盐在鲜叶中添加浓度为 0.02、0.1、2.0mg/kg时，平均回收率99.76%～103.36%，相对标准偏差 2.07%～4.33%；在干叶中添加浓度为0.02、0.5、2.0 mg/kg时，平均回收率 94.92%～102.18%，相对标准偏差2.66%～3.69%；在土壤中添加浓度为0.005、0.02、2.0 mg/kg时，平均回收率96.76%～99.02%，相对标准偏差2.23%～4.48%。回收率和相对标准偏差均符合农药残留试验的要求（表1）。

表1 甲维盐在烟叶和土壤中方法回收率试验结果Table 1 Results of emamectin benzoate method recovery in tobacco and soil

2.4 最佳操作条件的选择

2.4.1 检测波长及流动相的选择 由甲维盐的紫外光谱图可以看出，AVM-B1a和B1b的最大吸收波长均在245 nm附近，由于流动相在该波长处无吸收且对B1a和B1b峰位置无干扰，故检测波长确定为245 nm（图2）。通过几种流动相：甲醇/水、乙腈/水、甲醇/乙腈/水等不同比例的选择，以保留时间适中、分离效果较好等因素最终确定为甲醇/水（88:12，V/V）作为该方法的流动相[4]。

2.4.2 提取方法的选择 比较不同提取方法匀浆法和振荡法的提取效率，并比较不同提取溶剂体系丙酮/水、乙腈/水和甲醇/水的提取率。最终确定以振荡法提取，将丙酮和水作为提取溶剂，比例为(1∶1，V/V)，提取率为 90%以上，明显高于其他几种方法，且振荡法提取的杂质较匀浆法少，以 1∶1比例的丙酮/水提取后再以 10%氯化钠溶液和二氯甲烷萃取，能更好的避免将色素、焦油及水溶性杂质提取出来，使提取液更洁净，无较大干扰峰。样品图谱（图3～4）。

2.4.3 SPE柱净化效果的选择 固相萃取(Solid phase Extraction SPE)[13]，是一种试样预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，近年来得到了快速的发展，原理是利用组分与吸附剂固定相间选择性吸附与选择性洗脱的过程，达到提取分离、净化和富集的目的，在样品处理中也愈来愈多地被使用。净化过程选择SPE柱的种类尤为重要，它直接关系到方法的回收率。目前常用的SPE柱主要包括C18-SPE柱[11]、florisil-SPE柱和碱性氧化铝SPE柱[13]。张启迪等[13]比较了Waters sep-pak Vac 12cc-(2g)碱性氧化铝SPE柱和C18-SPE柱在残留检测中的净化效果，经柱净化的样品，杂质峰较多且对甲维盐有干扰。经多次调整流动相比例及洗涤、洗脱的乙腈比例，但结果都不理想。本试验采用florisil-SPE柱经过不同配比丙酮/二氯甲烷淋洗，采用1∶9、2∶8、4∶6、6∶4配比淋洗，以丙酮/二氯甲烷（6:4，V/V）淋洗，取得较理想回收率（表2）。

表2 florisil-SPE柱中不同配比溶剂淋洗试验Table2 Elution experiment of different proportion of solvent with florisil-SPE columns

图2 甲维盐标样Fig.2 AVM Standard sample

图3 烟叶-对照、添加样品Fig.3 Tobacco CK and tobacco spiked sample

图4 土壤-对照、添加样品Fig.4 Soil CK and soil spiked sample

3 讨 论

由于该药的广泛使用，而且甲维盐使用剂量小，分子量大，缺乏显著的分析基团，其残留分析过程比较复杂。十几年来，人们从分离和检测两方面对其残留分析方法进行了深入探索。由于该药分子量大（B1a 873.11，B1b 859.08），GC、GC-MS均无法检出，GB19337—2003[14]给出了用 HPLC-紫外检测器检测阿维菌素原药和乳油的方法，但直接用于农药残留检测时，检测限过高，不适用于进行低残留的样品检测。国际贸易中对其残留指标的检测也十分重视，各国制订了相当严格的MRL值，美国、欧盟、食品法典委员会（CAC）和中国均制定了阿维菌素在作物中的最高残留限量（MRL）。我国制定阿维菌素在叶菜类中的 MRL为0.05mg/kg[15]。但未制定烟草中 MRL标准，目前FAO/WHO也未对烟草中甲维盐最大残留限量（MRL）作出规定。本方法的各项试验结果表明，采用丙酮/水提取，Florisil-SPE柱净化，液相色谱紫外检测器(UVD)测定，方法的最低检出限为2.0×10-10g（B1a）；1.0×10-9g（B1b）；最低检出浓度干烟叶中B1a为0.005 mg/kg、B1b为0.02 mg/kg，均能够满足烟草中甲维盐残留量的检测。

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