细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因酶切图谱分析

魏荣旋,赵 庆,王 和

(1.遵义医学院附属三院 检验中心,贵州 遵义 563002;2.贵阳医学院微生物教研室,贵州 贵阳 550004)

细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因酶切图谱分析

魏荣旋1*,赵 庆1,王 和2

(1.遵义医学院附属三院 检验中心,贵州 遵义 563002;2.贵阳医学院微生物教研室,贵州 贵阳 550004)

目的探讨细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌隐蔽性质粒B(cppB)基因的影响以及细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB的变异特点。方法用青霉素诱导淋病奈瑟菌成为细胞壁缺陷型并获得其纯培养物,cppB基因特异性引物PCR检测细胞壁缺陷型纯培养物的cppB基因,并对其cppB基因PCR扩增产物进行限制性核酸内切酶图谱分析。结果细菌型和细胞壁缺陷型均具有 cppB基因扩增产物,经过限制性内切酶HindⅢ、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ消化和电泳,在 5%PAGE凝胶电泳中,呈现出相同的电泳条带。结论淋病奈瑟菌细菌型及其细胞壁缺陷型对cppB基因限制性核酸内切酶(HindⅢ、HinfⅠ、MspⅠ、HpaⅡ)的分析没有发现淋病奈瑟菌L型具有与其亲代细菌型不同的图谱,提示细胞壁缺陷没有导致淋病奈瑟菌的cppB基因发生这些核酸酶切位点中核苷酸序列的改变。

细胞壁缺陷型;淋病奈瑟菌;cppB基因;酶切

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1353)

细胞壁缺陷型(又称细菌L型)是细菌最常发生的变异类型,它不仅导致细菌的形态发生改变[1,2,3],同时也常常导致细菌的生长繁殖、代谢活性、致病性、抗原性、抗生素敏感性、遗传等方面特性的发生改变[4,5,6]。淋病奈瑟菌96%以上的菌株携带隐蔽性质粒B(cppB)基因,即使在不含cppB的菌株的染色体也整合有携带隐蔽性质粒B[3,6,7]。由于临床治疗淋病奈瑟菌的感染广泛采用青霉素或β-内酰类等抗生素进行治疗,发生细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌的情况不可避免,用常规培养的方法难以检测到病原菌,常常导致漏诊或误诊。国际上常使用PCR检测病员的分泌物或培养物cppB基因来鉴定淋病耐瑟菌或诊断淋病。也有文献报道[3,9]细胞壁缺陷型细菌可发生携带的质粒的丢失,甚至染色体基因序列也可以发生改变。为了进一步探讨细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌cppB基因的影响、了解其变异的特点,我们对淋病奈瑟菌L型(青霉素诱导形成)的cppB基因进行PCR检测、并对产物进行酶切分析,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种 淋病奈瑟菌标准株(29106-6),北京中国药品和生物制品鉴定所提供。

1.1.2 非高渗培养基 肝消化液,按文献方法[4,5]制备。

1.1.3 诱导剂 青霉素G钠注射液(批号

B20090525),由哈尔滨制药总厂提供。

1.1.4 cppB PCR试剂盒 引物的碱基序列为:5,-CTTGGCTGGTTGATTCAAG-3,, 5,-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3,,由华美生物工程公司提供。

1.1.5 限制性内切酶 HindⅢ切割位点:5,…A↓AGCTT…3,,HinfⅠ切割位点:5,…G↓ATTC…3,,HpaⅡ切割位点:5,…C↓CGG…3,,MspⅠ切割位点:5,…C↓CGG …3,,由华美生物工程公司提供。

1.2 方法

1.2.1 L型诱导 将淋病奈瑟菌接种于含5 ml肝消化液培养基的小方瓶内,加入青霉素使其终浓度为15 u/ml。用胶塞盖紧瓶口置普通温培养箱内37℃培养,在倒置显微镜高倍镜下逐日观察细菌型及L型的生长情况。L型形成后取培养物经0.22 μ m孔径滤菌器过滤并接种0.5 ml滤过物于不含诱导剂的5 ml肝消化液培养基内,每5-7天传一代培养获得L型纯培养物。每次传代分别收集L型培养物,置-20℃冰箱内保藏备用。

1.2.2 细菌型培养 将淋病奈瑟菌接种于不含诱导剂的5 ml肝消化液培养基的小方瓶内,用胶塞盖紧瓶口置普通温培养箱内37℃培养。每天取细菌型培养物0.5 ml接种于不含诱导剂的5ml肝消化液培养基内传代培养和收集培养物置-20℃冰箱内保藏备用。

1.2.3 cppB基因的PCR 根据淋病奈瑟菌PCR诊断试剂盒说明书推荐的程序进行。

1.2.4 cppB基因的酶切分析

1.2.4.1 淋病奈瑟菌细菌型和细胞壁缺陷型cppB基因PCR产物的纯化 按文献[5]提供的方法进行。

1.2.4.2 cppB基因(纯化后)的DNA含量的测定在紫外分光光度计波长为260 nm和280 nm下分别测量其吸光度值,按文献[8,9]提供的公式计算样本的DNA含量。

1.2.4.3 限制性核酸内切酶处理 按试剂盒推荐的程序,分别用HindⅢ 、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ对纯化后的细菌型和细胞壁缺陷型的cppB基因PCR扩增产物进行消化。反应体系为:

无菌去离子水 -10×Buffer 2μ l Acetylated BSA 2μ l DNA 底物 1μ g限制性内切酶 2-4 μ l总体积 20μ l

1.2.4.4 取消化过的细菌型和细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌的cppB基因PCR产物5 μ l分别加入等量的载样缓冲液,各样品加于5%PAGE凝胶样品孔内,以电压1-8 V/每cm胶距电泳10小时,取出凝胶固定、银染色、观察结果并照相。

2 结果

2.1 淋病奈瑟菌cppB基因PCR结果 淋病奈瑟菌细菌型和细胞壁缺陷型(1-4代)样品经PCR扩增和电泳后,能够观察到与试剂盒阳性对照一致的明显的cppB基因条带,但细胞壁缺陷型5代后培养物未能检出阳性DNA条带。

2.2 cppB基因PCR产物限制性核酸内切酶图谱限制性核酸内切酶HindⅢ不能切开细菌型以及L型的cppB基因扩增片段,HpaⅡ酶将细菌型和L型的cppB基因扩增片段分别切开为相同的两条带(图1)。HinfⅠ不能切开细菌型和L型的cppB基因扩增片段。MspⅠ酶切细菌型和L型可将两型细菌的cppB基因扩增片段分别切开为相同的两条带(图2)。

图1 淋病奈瑟菌 HindⅢ和 HpaⅡ酶切图谱

图2 淋病奈瑟菌HinfⅠ和MspⅠ酶切图谱

3 讨论

利用分子生物学技术对分子结构进行分析,聚合酶链反应-单链构型多态性(PCR-SSCP)、限制性核酸内切酶等方法已广泛用于核酸的组成及其同源性和特异性的研究[8,9]。限制性核酸内切酶具有从分子内部特异性切割核酸的作用,使用某种具有已知切割位点的限制性核酸内切酶对目的基因或核酸进行消化,通过对其产物的分子量、组成等分析可了解该基因或核酸的组成及其同源性。如果核酸的酶切位点发生改变,可以通过电泳技术观察到不同的条带,通常提示组成该基因或核酸的核苷酸序列发生了改变。

本文结果显示淋病奈瑟菌稳定L型的cppB基因PCR扩增产物经四种核酸内切酶分别消化及5%的聚丙酰胺凝胶电泳技术观察到与其亲代细菌型相同的条带,提示淋病奈瑟菌稳定L型暂时保留的cppB基因并没有发生这些核酸酶切点中核苷酸序列的改变和仍然具有与其亲代细菌型相同的核酸酶切点。结合文献[10]资料,提示淋病奈瑟菌L型cppB基因的核苷酸序列可能发生微小的改变或点突变,但不是HindⅢ、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ这四个限制性核酸内酶切位点的改变。

因此可以推断:淋病奈瑟菌L型细菌的变异不是简单的形态学表型变异,而可能是涉及到1个至数个核苷酸的改变以及最终导致隐蔽性质粒cppB基因丢失[6,10]的遗传型突变。

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Analysis of the Cryptic Plasmid B Gene of Cell Wall Deficient Neisseria gonorrhoeae by Restriction Enzyme Map

WEI Rong-xuan1*,ZHAOQing1,WANG He2.(1.The Laboratory Center,the3rd Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi563002,China;2.TheDepartment of Mic robiology,Guiyang Medical College,Guiyang550004,China)

Objective To probe influence of cellwall deficiency on the Cryptic PlasmidB gene of N.gonorrhoeae andits characteristic variation.MethodsThe N.gonorrhoeae was induced into L-form by penicillin and the cppB gene of the pure culture of L-form was determined by PCR and Restriction Enzyme(HindⅢ,HinfⅠ ,MspⅠ ,HpaⅡ).ResultsBy PCR,the cppB geneswere be found inboth the bacterial form and the L-forms of N.gonorrhoeae.There were same bands in the bacterial form and the L-forms by Restriction Enzyme Map.ConclusionThe Restriction Enzyme Mapswere not different in the bacterial form and the L-forms.These were shown that base alignment of cell wall deficiency on the Cryptic Plasmid B would not change by Restriction Enzyme of HindⅢ,HinfⅠ ,MspⅠand HpaⅡ.

L-form;N.gonorrhoeae;cppB gene;Restriction Enzyme Map

R372

A

1007-4287(2010)09-1353-03

*通讯作者

book=1354,ebook=415

2010-06-21)