凝血酶致大鼠脑水肿与脑内MMP-9、MMP-2蛋白表达关系的实验研究

江汉秋,刘 群,陈 志,张 昱

(1.首都医科大学附属北京同仁医院神经内科,北京 100730;2.吉林大学第一医院神经内科;3.吉林大学第一医院泌尿系统疾病诊治中心)

凝血酶致大鼠脑水肿与脑内MMP-9、MMP-2蛋白表达关系的实验研究

江汉秋1,刘 群2,陈 志3,张 昱2

(1.首都医科大学附属北京同仁医院神经内科,北京 100730;2.吉林大学第一医院神经内科;3.吉林大学第一医院泌尿系统疾病诊治中心)

目的探讨凝血酶对大鼠脑内MMP-9、MMP-2蛋白表达的影响。方法Wistar大鼠随机分为假手术组、对照组及凝血酶实验组。实验组脑内注入凝血酶,在不同时间点采用干湿重法测脑水含量,Western blog方法检测脑内MMP-9、MMP-2蛋白的表达。对照组注入等量生理盐水。结果脑组织水含量在凝血酶注入后12 h开始增加,3 d达高峰。MMP-9在注射凝血酶后12 h开始明显表达增加,与对照组相比差异显著(P＜0.01),3 d达高峰,随后持续下降。MMP-2在注射凝血酶后24h才开始有明显表达,后持续增多,5 d达高峰,随后有所下降,与对照组相比差异显著(P＜0.05)。结论凝血酶在脑出血后脑水肿及脑组织损伤中起了关键的作用,MMP-9、MMP-2参与了急性期脑水肿过程。

凝血酶;脑水肿;MMP-9;MMP-2;脑出血

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1363)

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后脑组织损伤机理一直是国内外研究的热点,但目前仍不十分清楚。动物实验已经证实ICH后血块衍生物、最初的物理性损伤和血肿占位效应是重要原因,而凝血酶(thrombin,TB)是血肿凝血反应过程中释放的主要物质。本课题组已经研究证实,在大鼠脑内注入凝血酶后,脑组织水含量增加,免疫组化初步明确了其可导致脑内基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)和MMP-2表达增多[1]。本文将应用Western blot方法检测大鼠脑内注入TB后脑组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达的变化,探讨凝血酶导致ICH脑水肿的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Wistar大鼠140只,鼠龄3-4个月,体重250-300 g,由长春高新技术动物中心提供。将大鼠随机分成假手术组(20只)、对照组(60只)及凝血酶组(60只)。凝血酶组及对照组分别在术后3 h、12 h、24 h、3 d 、5 d、7 d 处死动物,取脑。每个时间点进行脑组织水含量及MMP-9、MMP-2蛋白表达检测。各时间点脑组织水含量和蛋白表达检测各5只大鼠。

1.2 动物模型制备

用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(300 mg/kg)。取右侧尾壳核为注射部位,在脑立体定位仪下,其坐标为 R3.0 mm、A0.2 mm、H5.5mm,实验组注入 10 μ凝血酶+50 μ l生理盐水(凝血酶购自Sigma公司)。用微量进样器在约5min注血完毕,留针10 min。实验对照组注入50 μ l生理盐水,方法同上。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 脑组织水含量检测 不同组别、不同时间点麻醉大鼠,断头处死,迅速取出脑组织,用刀片以针尖为中心取厚度约4 mm右侧脑组织,立即称湿重。将组织放入烘干箱100℃烘烤24 h,再称干重。按Elliot公式计算脑组织水含量:脑组织水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.2 Western blot方法检测MMP-9、MMP-2的表达

各组取于距血肿灶外侧缘2mm左右取脑组织。蛋白定量后,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜,加入含一抗(分别为兔抗鼠MMP-9、兔抗鼠MMP-2,均购自武汉博士德生物工程有限公司)的反应液,后加入含二抗反应液(羊抗兔IgG)。结果采用国产HP IAS21000型图像分析仪测定平均光密度值。

1.4 统计学分析 运用SPSS16.0软件,实验数据采用(±s)表示。各组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 脑组织水含量

凝血酶组脑组织水含量在3 h较对照组变化不明显,虽有升高但与对照组相比无显著性差异(P＞0.05),12 h已开始有较明显的变化,24 h-3 d时脑组织水含量变化最明显,3 d达高峰,与对照组相比差异非常显著(P＜0.01),7 d时脑组织水含量明显减少与对照组相比仍差异显著(P＜0.01)(表1)。

2.2 各组MMP-9蛋白在不同时程的表达

在假手术组MMP-9表达量很少。3 h TB组MMP-9表达增加不明显,与对照组相比无显著差异(P＞0.05),同样在24 h开始明显增加,3 d达到高峰,后逐渐下降,7 d时仍有较明显表达。除3 h外各时间点与对照组相比较差异显著(P＜0.01)(表2)。

2.3 各组MMP-2蛋白在不同时程的表达

在假手术组MMP-2几乎无明显表达。脑内注入TB后3 h已可见少量的MMP-2表达,12 h出现了短暂性表达下降,24 h后开始增多,第3 d已可见较为明显的阳性表达,5 d达到高峰,后开始逐渐下降。TB组各时间点MMP-2表达平均光密度值与对照组相比差异均非常显著(P＜0.05)(表3)。

表1 各组脑组织水含量的比较(±s)

表1 各组脑组织水含量的比较(±s)

注:与对照组相同时间比较ΔP＜0.01,*P＜0.05。下同。

组别 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手术组 63.60±2.80对照组 72.07±2.52 76.31±3.53 79.52±2.92 73.58±1.91 69.37±2.45 67.59±2.82 TB 组 75.02±1.95 83.87±4.00Δ 90.57±2.08Δ 91.66±3.47Δ 86.75±1.09Δ 77.70±2.53Δ

表2 各组病灶周围脑组织MMP-9平均光密度值(±s)

表2 各组病灶周围脑组织MMP-9平均光密度值(±s)

组别 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手术组 36.09±3.68对照组 40.92±2.95 49.44±3.61 59.41±3.88 78.60±3.40 53.94±2.98 39.15±3.55 TB 组 43.31±3.22 63.04±4.68Δ 104.03±6.00Δ 183.27±7.32Δ 122.06±6.63Δ 77.16±4.94Δ

表3 各组病灶周围脑组织MMP-2平均光密度值(±s)

表3 各组病灶周围脑组织MMP-2平均光密度值(±s)

组别 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手术组 15.80±2.17对照组 19.70±2.40 18.54±1.88 29.48±3.70 40.63±3.51 45.79±2.72 43.13±2.28 TB 组 27.48±3.46Δ 23.03±2.35* 63.74±4.11Δ 81.34±4.27Δ 103.29±5.56Δ 87.82±4.66Δ

3 讨论

目前关于ICH与MMPs关系的研究还比较少,近些年来才有涉及。Power等[2]应用凝胶原酶诱导ICH模型证实,ICH 后MMP-2、3、7、9 mRNA 表达均升高,并参与了ICH后的炎性反应及细胞死亡过程。在随后,Abilleira等[3]等对ICH患者MMP-9的改变及其是否与脑水肿有关进行了探讨。发现ICH患者出现神经症状后24h内MMP-9浓度显著升高。深部ICH患者的MMP-9浓度与出血周围水肿区的大小、意识障碍的加重显著相关。这是首次发现人类ICH后血浆内MMP-9浓度升高的研究。随后Alvarez-Sab í n等[4]对 ICH 患者研究发现,MMP-9的表达增多与脑组织周围水肿有明显的相关性。由此可见,MMP-9、MMP-2在ICH后脑组织损伤中占有十分重要的地位,尤其MMP-9在血肿周围脑组织水肿中具有重要的作用。

TB对ICH后脑水肿的产生具有重要的作用。大量的实验表明TB在血脑屏障(blood brain barrier,BBB)破坏过程中具有重要作用。Lee等[5]在大鼠基底节注射TB,发现TB可诱发明显的脑水肿,应用TB抑制剂水蛭素等可抑制脑水肿的形成,说明TB在ICH脑水肿形成起重要作用。他们应用同位素标记的α-氨基异丁酸测定BBB通透性发现,认为TB的细胞毒性作用及对BBB通透性的影响是其诱发脑水肿的机制。此外,Sansing等[6]研究表明,血小板计数与脑水肿明显相关,出血部位激活的血小板释放因子可以与TB相互作用,增加血管通透性,促进了脑水肿的发展。Hua等[7]在鼠脑分别注入自体全血、全血加水蛭素、袋装红细胞、TB、生理盐水,发现大鼠前肢的状态与脑水肿呈平行关系。注入TB可引起神经功能缺损,而水蛭素可减轻ICH后的神经功能缺损,袋装红细胞可以诱发迟发的脑水肿与迟发的神经功能缺损有关。

本研究已发现在TB注入12 h后开始脑组织病理损伤及脑组织水含量增加,在24 h更为明显,3 d达到高峰。可见TB在ICH后12 h的脑水肿,尤其是24 h-3 d期间占有绝对优势。ICH后的24 h-3 d期间正是BBB受损最为严重时期,也是脑组织神经元变性坏死、胶质细胞开始增生、炎性细胞浸润等病理改变最明显的阶段,而此时也是血肿大量释放TB发挥作用的时间点,故可推测TB释放造成早期ICH的脑水肿。

本实验的Western blot结果证实MMP-9表达量在TB组3 h增加不明显,同样在24 h开始明显增加,3 d达到高峰,后明显下降。TB组3 h也已可见少量的MMP-2表达,12 h出现了短暂性表达下降,24 h后开始增多,5 d达到高峰,后开始逐渐下降。从以上关于脑内注入TB后的MMP-9、MMP-2的研究发现,二者的表达有所不同。①从表达量上看,MMP-9平均灰度值整体高于MMP-2的表达;②从达到高峰的时间上来看,MMP-9只有一个高峰,是在注入TB后3 d,而MMP-2有2个高峰,即注入后3 h及5 d;③从表达的持续时间来看,MMP-2的表达持续时间更长;

Rosenberg等[8]在SHR脑缺血再灌注损伤后3 h即见MMP-2阳性表达的星形胶质细胞。24 h MMP-9开始有表达,免疫组化48 h时可在血管内皮细胞、中性粒细胞、神经元中观察到MMP-9阳性细胞表达;而在5 d直到21 d后仍可在缺血周围星形胶质细胞中观察到MMP-2阳性细胞。Anna[9]等研究发现,MMPs的表达在脑缺血后有2个高峰,即缺血后4 h有MMP-2的短暂性升高,主要在星形胶质细胞表达,MMP-9则在缺血后4 h-4 d主要在神经元及髓鞘纤维束表达,4 d后则为小胶质细胞、巨噬细胞内MMP-2的表达,这与随后的Magnoni等研究结果基本相同[10]。

通过以上的结果表明,脑内注入TB后MMP-9、MMP-2具有与ICH基本相同的表达趋势。TB在脑组织的损伤中占有十分重要的地位,ICH后TB的释放是ICH脑组织改变的非常关键的有害物质。TB可能正是通过促使MMP-9、MMP-2的上调而发挥着毒性作用。在组织损伤早期,MMP-9发挥了主要的作用,而MMP-2可能是其在超早期发挥毒性作用的同时更主要的担当了组织损伤后的修复任务。

[1]江汉秋,刘 群,刘 瑾,等.凝血酶对大鼠脑内MMP-9、MMP-2表达的影响[J].中风与神经疾病杂志,2006,23(1):75.

[2]Power C,Henry S,Del Bigio MR,et al.Intracerebral hemorrhage induces macrophage activation and matrix metalloproteinases[J].Ann Neurol,2003,53(6):731.

[3]Abilleira S,Montaner J,Molina CA,et al.Matrix metalloproteinase-9 concentration after spontaneous intracerebral hemorrhage[J].J Neurosurg,2003,99(1):65.

[4]Mun-Bryce S,Wilkerson A,Pacheco B,et al.Depressed cortical excitability and elevatedmatrix metalloproteinases in remote brain regionsfollowing intracerebral hemorrhage[J].Brain Res,2004,1026(2):227.

[5]Lee KR,Kawai N,Kim S,et al.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage:effects of thrombin on blood flow,blood-brain barrier permeability,and cell survival in a rat model[J].JNeurosurg,1997,86(2):272.

[6]Sansing LH,Kaznatcheeva EA,Perkins CJ,et al.Edema after intracerebral hemorrhage:correlations with coagulation parameters and treatment[J].J Neurosurg,2003,98(5):985.

[7]Hua Y,Schallert T,Keep RF,et al.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat[J].Stroke,2002,33(10):2478.

[8]Rosenberg GA,Cunningham LA,Wallace J,et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain:activation of MMP-9 linked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures[J].Brain Res,2001,893(1-2):104.

[9]Planas AM,Sol é S,Justicia C.Expression and activationof matrix metalloproteinase-2 and-9 in rat brain after transient focal cerebral ischemia[J].Neurobiol Dis,2001,8(5):834.

[10]Magnoni S,Baker A,George SJ,et al.Differential alterations in the expression and activity of matrix metalloproteinases 2 and 9 after transient cerebral ischemia in mice[J].Neurobiol Dis,2004,17(2):188.

Effect of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 in rats brain after injection thrombin

JIANG Han-qiu,LIU Qun,CHEN Zhi,et al.(Department of Neurology,Beijing Tongren Hospital of Capital Medical University,Beijing100730,China)

ObjectiveTo study effect of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 in rats brain after injection thrombin.MethodsWistar rats were divided randomly into sham-operated group,control group and experiment group.The animals of experiment group were injected thrombin in brain.At the due time some rats were killed and brain tissue was removed to measure the water content by dry-wet weight method.The others were to measure of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 by Western blot.The animals of control group were injected aequales liquor natrii chloridi isotonicus.ResultsThe water content of brain increased at 12 hours after injection thrombin,and peaked at 3 days.Comparedwith control group,in experiment group the expression of MMP-9were observed increasing obviously at 12 hours after injection thrombin,and peaked at 3 days,then decreased gradually.Some of MMP-2 protein were observed until 24 hours in experiment group,and peaked at 5 days,then decreased gradually,and was significantly more than control group(P＜0.01).ConclusionThrombin played a important role in intracerebral hemorrhage on cerebral edema and tissue impairment.MMP-9 andMMP-2 contributed to brain edema in the acute phase of ICH.

Thrombin;cerebral edema;MMP-9;MMP-2;ICH

R743.34

A

1007-4287(2010)09-1363-03

2010-03-14)