海洛因及补偿AMP和GMP对大鼠海马组织腺苷脱氨酶的影响

阚慕洁,付海英,洪 敏,刘 畅

(吉林大学白求恩医学院基础生物化学教研室,吉林长春 130021)

海洛因及补偿AMP和GMP对大鼠海马组织腺苷脱氨酶的影响

阚慕洁,付海英,洪 敏,刘 畅*

(吉林大学白求恩医学院基础生物化学教研室,吉林长春 130021)

目的探讨海洛因及补偿AMP和GMP对海马组织嘌呤核苷酸分解代谢关键酶ADA的影响。方法剂量递增腹腔注射海洛因及嘌呤核苷酸,建立了海洛因及补偿AMP和GMP的给药与依赖大鼠模型,用试剂盒检测海马组织腺苷脱氨酶(ADA)的活性。提取海马组织总RNA,采用逆转录聚合酶链反应检测海马组织ADA mRNA的水平,以βactin mRNA为内标。结果海马组织中ADA含量测定结果显示,与盐水对照组相比,核苷酸组和海洛因组的海马组织ADA含量明显升高(P＜0.05,n=10);与海洛因组相比,海洛因加核苷酸组、核苷酸3天组的海马组织ADA含量明显降低(P＜0.05,n=10),核苷酸9天组降低更为显著(P＜0.01,n=10)。海马组织中ADA mR NA的水平结果显示,与盐水对照组相比,海洛因组ADA mRNA的相对表达量明显增高(P＜0.05,n=3),其余各组与盐水对照组相比无统计学意义;与海洛因组相比,海洛因加核苷酸组、戒断3天组、戒断9天组、核苷酸3天组和核苷酸9天组ADA mR NA的相对表达量明显降低(P＜0.01,n=3)。结论海洛因通过影响海马组织ADA的活性,进而促进嘌呤核苷酸的分解代谢,嘌呤核苷酸和/或代谢产物可能通过某些机制影响海洛因对海马组织的作用,其机制有待进一步研究。

海洛因;大鼠;腺苷脱氨酶;AMP/GMP;海马

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1372)

海洛因的滥用已成为全球关注的医学和社会问题。药物成瘾是以强迫性用药为主要特征的慢性复发性脑疾病。学习记忆已被证实在成瘾行为的形成和保持中发挥重要作用[1]。海马是学习与记忆中枢,可能在成瘾中扮演重要角色。阿片类药物依赖性的形成涉及多重机制,但是迄今为止,确切机制尚未明了。本实验室首先发现并报告了吗啡促使大鼠血液中尿酸增高的现象[2]。后来多次实验反复都证明了这一现象。尿酸在灵长类动物包括人是嘌呤代谢的终末产物,在啮齿类动物是次终末产物。在探索尿酸增高原因时我们发现,吗啡给药大鼠脑、肝脏、小肠、肌肉组织中的ADA含量明显增高,自然戒断后开始下降[3]。吗啡和海洛因能促使脑细胞中嘌呤核苷酸大量分解、合成不足;脑组织中可能存在嘌呤核苷酸“亏欠”的问题,这可能是阿片滥用造成的躯体损害、成瘾的原因。本研究建立了海洛因及补偿AMP和GMP的给药与依赖大鼠模型,以海马组织为主要研究对象,探讨海洛因及补偿AMP和GMP对海马组织嘌呤核苷酸分解代谢关键酶ADA的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海洛因:吉林省公安厅提供,纯度98%,用生理盐水配制后抽滤除菌;单磷酸腺苷(AMP)及单磷酸鸟苷(GMP)(AMRESCO);腺苷脱氨酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;722E型可见光分光光度计(上海光谱仪器有限公司制造);恒温水浴箱;美国TP-200S型电子天平;Trizol核酸提取液(GIBIO公司);AMV反转录酶、Rnasin(Promega公司);OligodT、dNTP和TaqDNA聚合酶(鼎国公司);DL2000 marker(宝泰克公司);特异引物由宝生物公司合成,顺序如下:ADA扩增产物长度为258 bp。上游引物:5′GCAACATTATCGGCATGGAC 3′下游引物 :5′CAAGATCCACAACCTCATCAG3′;β-肌动蛋白[4]扩增产物长度为 511 bp。上游引物:5′GAAATCGTGCGTGACATTAA3′下游引物 :5′CTAGAAGCATTTGCGGTGC-A3′;PTC-200梯度PCR仪;上海惠普7550型紫外分光光度计;北京六一仪器厂DYY-III4型稳压稳流电泳仪;紫外透射检测仪;Kodak凝胶电泳呈像分析系统(EDAS)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及动物模型的建立 Wistar大鼠80只,体重150-200 g,本校实验动物部提供,自由摄食、饮水。随机分成8组,盐水对照组(NS),海洛因组(H),核苷酸对照组(A),海洛因加核苷酸组(AH),戒断3天组(W3),戒断9天组(W9),核苷酸3天组(A3),核苷酸9天组(A9),每组10只。对照组d1-d10每日两次腹腔注射(ip)生理盐水,注射体积及时间与当日海洛因给药体积及时间相同,d11处死。海洛因组d1-d10每日两次(AM7:00和PM7:00)ip海洛因,每日次剂量依次为 0.50、0.75、1.25、2.00 、3.00 、4.25 、5.75 、7.50 、7.50 、7.50 mg◦kg-1体重,d11处死。核苷酸对照组d1-d10每日两次(AM7:00和PM7:00)ip核苷酸(AMP与GMP等摩尔混合),每日次剂量均为 7.5 mg◦kg-1体重,d11处死。海洛因加核苷酸组d1-d10每日两次(AM7:00和PM7:00)ip核苷酸和海洛因,核苷酸剂量同核苷酸对照组,海洛因剂量同海洛因组,d11处死。戒断3天组d1-d10每日两次ip海洛因(同海洛因组),d11-d13停药,d14处死。戒断9天组d1-d10每日两次ip海洛因(同海洛因组),d11-d19停药,d20处死。核苷酸3天组d1-d10每日两次ip海洛因(同海洛因组),d11-d13每日两次ip核苷酸(给药同核苷酸对照组),d14处死。核苷酸9天组d1-d10每日两次ip海洛因(同海洛因组),d11-d19每日两次ip核苷酸(给药同核苷酸对照组),d20处死。

1.2.2 海马组织ADA活性测定 按试剂盒说明书操作。

1.2.3 Trizol法提取海马组织总RNA 按试剂说明操作。

1.2.4 RT-PCR法检测海马组织ADA mRNA

1.2.4.1 RT-PCR法:大约2 μ g RNA 样品用于 cDNA合成(按试剂说明操作),1 μ lcDNA(大约代表0.1 μ g cDNA)用于PCR扩增。PCR反应混合物组成为:PCR 缓冲液(10 mmol◦L-1tris-HCl,pH 8.3;50 mmol◦L-1KCl;1.5 mmol◦L-1MgCl2;0.001%明胶),0.2 mmol◦L-1dNTPs,50 pmol◦L-1的 ADA 上游和下游引物,10 pmol◦L-1的β-肌动蛋白上游和下游引物,2.5单位的TaqDNA聚合酶,总反应体积为50 μ l。对于ADA的扩增反应条件为95℃3 min 95℃35sec,64℃1 min,72℃1 min,共31个循环。

1.2.4.2 ADA mRNA 鉴定:取 20 μ l PCR 反应产物做1.5%琼脂糖凝胶电泳,利用Kodak凝胶电泳呈像分析系统(Electrophoresis Documentation Analysis System,EDAS)对扩增带进行强度分析,分别计算每条泳道的ADA/β-肌动蛋白总强度比值,用来表示ADA mRNA的水平。

1.2.5 统计学处理 各组数据用SPSS统计分析软件进行方差齐性检验及成组设计资料t检验分析。

2 结果

2.1 海马组织ADA含量的测定

海马组织中ADA的测定结果见图1。盐水对照组到核苷酸9天组,海马组织ADA的活性分别为2.32±0.52、3.83±1.25、4.78±1.81、2.9±0.91、3.04±1.62、3.16±1.06、2.64±0.42、2.28±0.65(n=10)

图1 海马组织腺苷脱氨酸活性

与盐水对照组相比,核苷酸组和海洛因组的海马组织ADA含量明显升高(P＜0.05);与海洛因组相比,海洛因加核苷酸组、核苷酸3天组的海马组织ADA含量明显降低(P＜0.05),核苷酸9天组降低更为显著(P＜0.01)。其余各组未见明显差异,但戒断3天和9天组与海洛因组相比有降低的趋势。

2.2 海马组织腺苷脱氨酶(ADA)的mRNA的表达

如图2所示,与盐水对照组相比,海洛因组ADA mRNA的相对表达量明显增高(P＜0.05),其余各组与盐水对照组相比无统计学意义;与海洛因组相比,海洛因加核苷酸组、戒断3天组、戒断9天组、核苷酸3天组和核苷酸9天组ADA mRNA的相对表达量明显降低(P＜0.01)。以β-肌动蛋白511为内参,海马组织ADA的基因表达水平分别为0.197±0.036、0.27±0.039、0.42±0.037、0.205±0.027、0.108 ±0.036、0.229±0.028、0.199±0.025、0.206±0.014(n=10)。

图2 海马组织腺苷脱氧酶的基因表达

3 讨论

吗啡海洛因可以促使大鼠血液中尿酸含量增高[2,7]。在灵长类动物包括人尿酸是嘌呤代谢的终末产物,在啮齿类动物是次终末产物。在探索尿酸增高原因时我们发现,吗啡给药大鼠脑、肝脏、小肠、肌肉组织中的ADA含量明显增高,自然戒断后开始下降[3]。同时发现吗啡可使C6神经胶质瘤细胞中嘌呤核苷酸补救合成的关键酶HGPRT和AK的基因表达下调,提示吗啡可能通过作用于补救合成的关键酶而使中枢神经细胞的核苷酸合成代谢出现障碍[5]。在PC12细胞实验中也获得类似的结果[6]。在吗啡依赖动物模型的基础上,建立了海洛因依赖动物模型,发现海洛因促进大鼠脑组织嘌呤核苷酸的分解代谢,而且可能是通过其分解代谢的关键酶腺苷酸脱氨酶(ADA)[7]。腺苷脱氨酶(ADA)是嘌呤核苷酸分解代谢的关键酶。ADA催化腺嘌呤核苷转化为次黄嘌呤核苷,进而分解成次黄嘌呤最终分解为尿酸;海马组织中ADA的测定结果显示,海洛因组和核苷酸组的海马组织ADA含量明显高于盐水对照组(P＜0.05);与海洛因组相比,海洛因加核苷酸组、核苷酸3天组的海马组织ADA含量明显降低(P＜0.05),核苷酸9天组降低更为显著(P＜0.01)。可见海洛因可以促进海马组织ADA的活性,进而促进嘌呤核苷酸的分解代谢,单独使用核苷酸也可促进海马组织ADA的活性,而当海洛因给药的同时补偿AMP和GMP时ADA的活性反而降低,停用海洛因后补偿核苷酸还能进一步降低ADA的活性,这些结果提示嘌呤核苷酸和/或代谢产物可能通过某些机制影响海洛因对海马组织的作用,其机制有待进一步研究。RT-PCR实验结果表明,海洛因给药均在不同程度上增加了海马组织ADA mRNA的水平。自然戒断后,ADA的基因表达很快恢复到对照组水平,但明显低于海洛因组(P＜0.01);单纯使用嘌呤核苷酸对ADA的基因表达无明显影响;但当海洛因给药同时补偿嘌呤核苷酸,海马组织ADA的基因表达明显低于海洛因组;海洛因停药后补偿嘌呤核苷酸ADA的基因表达也明显低于海洛因组;这结果与蛋白质水平的检测基本一致,提示了嘌呤核苷酸或其代谢产物可能通过某种途径对抗海洛因对海马组织ADA基因表达的影响,进而影响其蛋白质水平上的变化。这种影响是否提示嘌呤核苷酸对海洛因的成瘾存在一定程度的治疗作用?其相关机制还有待进一步的探索。

[1]Nestler EJ.Neurobiology.Total recall--the memory of addiction[J].Science,2001,292(5525):2266.

[2]刘剑凯,洪 敏,等.吗啡依赖大鼠血清尿酸及ALT、AST的检测分析.医药导报,2003,22(4):224.

[3]LIU C,LIU JK,KAN MJ,et al.Morphine enhances purine nucleotide catabolism in vivo and in vitro[J].Acta Pharmacol Sin,2007,28(8):1105.

[4]Negrini M,Monaco C,Vorechovsky I,et al.The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in breast carcinomas[J].Cancer Res,1996,56(14):3173.

[5]刘剑凯,洪 敏,赵小冬.吗啡对C6胶质瘤细胞嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的影响[J].中华医学杂志,2003,83(1):46.

[6]孙 婷,何海涛,阚慕洁,等.嘌呤核苷酸减弱吗啡抑制的PC12细胞嘌呤核苷酸合成代谢[J].吉林大学学报(医学版),2007,33(6):971.

[7]Yang YD,Zhang JZ,Sun C,et al.Heroin affects purine nucleotides catabolism in rats in vivo[J].Life Sci,2006,78(13):1413.

The effect of heroin and compensating AMP/GMP on adenosine deaminase of hippocampus in rats

KAN Mu-Jie,FU Hai-Ying,HONGMin,et al.(Department of Biochemistry,NormanBethune college of Medicine,JilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the effect of heroin and compensating AMP/GMP on the adenosine deaminase(ADA)which is the key enzyme of purine nucleotides catabolism of hippocampus in rats.MethodsWe established the heroin and compensating purine nucleotides model of rats.The activities of ADA in the hippocampuswasperformed.RT-PCRwas used to examine the expression level of ADA mR NA.β-actin was used as control gene in RT-PCR study.ResultsCompared with NS group,the activity of ADA in hippocampus of heroin group and purine nucleotides groupwere increased(P＜0.05,n=10);Comparedwith heroin group,the activity of ADA in heroin plus AMP/GMP group,A3 and A9 groupwere greatly decreased(P＜0.05,n=10).The level of transcript of ADA mRNA in hippocampus of heroin group was increased compared with NS group(P＜0.05,n=3);While compared withheroin group,the level of ADA mRNA were decreased in AH,W3,W9,A3 and A9 groups(P＜0.01,n=3).ConclusionHeroin could promote the purine nucleotides catabolism through changing the activity of ADA in hippocampus,Compensate AMP and GMP had some reverse function to heroin,the mechanism need to be explored in the future.

heroin;rat;adenosine deaminase;AMP/GMP;hippocampus

R961

A

1007-4287(2010)09-1372-03

吉林省卫生厅3D5098243426

*通讯作者

2009-02-28)