锌对糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的影响

董 宇,刘卫东,孙珉丹,李松鹤

(1.吉林大学第一医院 眼科,吉林 长春 130021;2.吉林大学第一医院 肾内科,吉林 长春 130021)

锌对糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的影响

董 宇1,刘卫东1,孙珉丹2,李松鹤1

(1.吉林大学第一医院 眼科,吉林 长春 130021;2.吉林大学第一医院 肾内科,吉林 长春 130021)

目的研究金属锌对大鼠糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响,证实锌对糖尿病视网膜病变的防治作用。方法用Wistar大鼠建立糖尿病视网膜病变模型,随机分成4组:正常对照组、正常补锌组、高糖组、高糖+锌组。3M后轻摘眼球,在视网膜切片上行VEGF免疫组化。结果正常对照组、正常+锌组及高糖+锌组视网膜石蜡切片中免疫组化染色VEGF阳性表达,高糖组视网膜石蜡切片VEGF免疫组化明显阳性表达,高糖组视网膜切片VEGF免疫组化IOD值与正常组、正常+锌组及高糖+锌组相比明显增高(P＜0.001),正常组视网膜切片VEGF免疫组化IOD值与正常+锌组及高糖+锌组相比无显著性差异(P＞0.05)。结论我们认为补充金属锌能减少糖尿病大鼠视网膜病变VEGF的表达,有防治DR的作用。

糖尿病;视网膜病;金属锌;血管内皮细胞生长因子

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1375)

糖尿病性视网膜病变(DR)是一种微血管病变,研究表明DR早期视网膜毛细血管的周细胞和内皮细胞损伤,基底膜增厚,进而引起管腔狭窄和血流改变,促进DR后期发生视网膜缺血、缺氧和新生血管的形成[1]。而血管内皮生长因子VEGF已被公认为DR新生血管生成的重要因子,因此我们通过对糖尿病大鼠补充金属锌治疗,探讨是否能减少视网膜组织VEGF的表达,从而推测金属锌对DR的防治作用,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 糖尿病动物模型的建立及分组

体重180-200 g的雄性Wistar大鼠50只,由吉林大学白求恩医学部基础医学院实验动物中心提供,适应性饲养7 d后用于本实验。选取其中40只随机分成4组:正常对照组(8只)、正常+锌组(8只)、建立糖尿病视网膜病变模型高糖组(12只)、建立糖尿病视网膜病变模型高糖+锌组(12只);正常+锌组每日硫酸锌15 mg/kg灌胃;高糖组腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin STZ)40 mg/kg体重(新配制的0.1mol/L柠檬酸缓冲液在水浴下配制成2%STZ溶液,PH4.4),以诱发糖尿病,正常对照组和正常+锌组仅注射同样体积的柠檬酸缓冲液,注射STZ 3d后测尿糖及血糖,以尿糖++++以上,空腹血糖16.5 mmol/L以上;尿量及饮水明显增多者列入糖尿病实验对象,实验期间大鼠正常饮食水,定期测血糖、尿糖及体重;高糖+锌组每日硫酸锌15 mg/kg灌胃并且腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin STZ)40 mg/kg体重(新配制的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液在水浴下配制成2%STZ溶液,PH4.4),以诱发糖尿病,注射STZ 3 d后测尿糖及血糖,以尿糖++++以上,空腹血糖16.5 mmol/L以上;尿量及饮水明显增多者列入糖尿病实验对象,实验期间大鼠正常饮食水,定期测血糖、尿糖及体重,实验期间大鼠正常饮食水,定期测血糖、尿糖及体重。3 M后各实验组动物过量麻醉,轻摘眼球后处死大鼠。(除去中间死亡的大鼠及血糖恢复鼠,最后实验结束时,每组有6只列入统计对象)。

1.2 组织学处理

将眼球固定于10%中性福尔马林中48 h,经乙醇常规脱水,二甲苯透明后浸腊包埋。连续5 μ m厚切片用于免疫组化。

1.3 免疫组化染色步骤

免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(S-P法),其操作步骤如下:(1)切片常规脱蜡、脱水。(2)PBS冲洗5 min。(3)3%H2O2-蒸馏水阻断内源性氧化物酶25 min。(4)PBS冲洗5 min,3次。(5)抗原修复。(6)山羊血清(1∶20)封闭30 min。(7)特异性一抗于切片上,孵育40 min。(8)PBS冲洗5 min,3次。(9)滴加相应的二抗(IgG或Biotin),孵育40 min。(10)PBS冲洗5min,3次。(11)加相应的三抗(S-A/HRP)孵育40 min。(12)PBS冲洗5 min,3次。(13)DAB-蒸馏水溶液显色。(14)Mayer苏木精复染,二甲苯透明,中性树胶封片。

1.4 采用Imagepro-Plus软件进行数据分析,应用计算机图像处理技术测定免疫组化视网膜组织累积光密度(integrated optical density,IOD)。

1.5 统计学分析

采用SAS9.0统计软件进行统计分析。VEGF免疫组化IOD值各组含量采用单因素方差分析。

2 结果

正常对照组、正常+锌组及高糖+锌组视网膜石蜡切片中免疫组化染色VEGF阳性表达(见图1、2、3)。

高糖组视网膜石蜡切片VEGF免疫组化明显阳性表达,在节细胞层尤其在内核层阳性表达(图4)。

图1 正常组视网膜石蜡切片VEGF免疫

图2 正常+锌组视网膜石蜡切片VEGF免疫

图3 高糖+锌组视网膜石蜡切片VEGF免疫

图4 高糖组视网膜石蜡切片VEGF免疫

高糖组视网膜切片VEGF免疫组化IOD值与正常组、正常+锌组及高糖+锌组相比明显增高(P＜0.01),正常组视网膜切片VEGF免疫组化IOD值与正常+锌组及高糖+锌组相比无显著性差异,P＞0.05,见表 1。

3 讨论

糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病的主要慢性并发症之一,它会造成具有特异性改变的眼底病变,以视网膜微血管的病理变化为特征,已经成为双眼盲的主要原因[2]。

表1 各组视网膜切片VEGF免疫组化IOD值

研究表明糖尿病患者视网膜缺血缺氧,导致血管内皮生长因子(VEGF)代偿性增加,促进了视网膜新生血管的形成及纤维增殖[3]。因此目前VEGF被公认为促进新生血管形成的最重要因子,是视网膜增殖性改变的启动因素[4,5]。另外DR发生导致蛋白质糖基化终末产物(AGEs)和一定的AGEs受体结合,诱导细胞间信号传导,使视网膜组织产生氧化应激反应及炎症反应,诱导视网膜VEGF分泌增多[6]。并且大量研究都表明糖尿病性视网膜氧化应激增加,氧自由基增多,氧化产物堆积,组织功能破坏[7,8]是DR发生、发展的重要环节。氧化应激增加的来源包括自由基生成增多或者抗氧化防护组织破坏增加[9]。而金属锌是一种抗氧化剂,其广泛存在于各种眼组织中,参与视黄醇还原酶及视黄醇结合蛋白的形成;锌还有保护视网膜上皮细胞正常形态的功能,锌缺乏则出现视网膜色素上皮细胞组织结构和形态的改变,视细胞外段变性。低锌还可使视网膜抗氧化系统,如SOD的活性降低,造成视觉细胞的过氧化损害[10]。有实验表明糖尿病患者体内缺乏微量元素锌,而且糖尿病有视网膜病变者比糖尿病无视网膜病变者更缺锌。锌的缺乏成为DR的危险因素[11]。实验表明锌对控制糖尿病大鼠高血糖和保护视网膜免遭氧化应激的损害中有积极的效应[12]。

我们在实验中发现STZ糖尿病大鼠通过补锌治疗后视网膜石蜡切片VEGF免疫组化阳性表达明显低于STZ糖尿病大鼠组,统计学有显著性差异(P＜0.001),正常对照组、正常+锌组视网膜石蜡切片中免疫组化染色VEGF阳性表达,但无显著性差异(P＞0.05)。这一结果能证实锌对糖尿病性视网膜病变VEGF过度表达具有抑制作用;并说明生理量补锌不会影响视网膜VEGF正常表达。因此推测补锌对糖尿病视网膜病变具有防治作用。

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Effect of Zinc on Vascular Endothelial Growth Factor expression in Retinopathy of diabetic rats

DONGYu1,LIU Wei-dong1,SUN Min-dan2,et al.(1.Department ofOphthalmology,First ClinicalHospital of JilinUniversity,Changchun130021,China;2.Department of Nephrology,First Clinical hospital of Jilin University)

ObjectiveTo research preventative and therapeutic effects of zinc on vascular endothelial growth factor(VEGF)in retinopathy of diabetic rat.Methods40Wistar ratwere divided randomly into 4 groups,The normal control group、the normal with zinc group 、the diabetic retinopathy rat model group、the diabetic retinopathy rat model with zinc group.After 3 month,eyeballs were picked,and immunohistochemistry staining for VEGF were done on retinal paraffin slide.ResultsImmunohistochemistry staining for VEGF showed positive expressionin all group,The diabetic retinopathy rat modelgroupishigher thanother groups,whichhave significant difference(P＜0.001).The control group、the normal with zinc group and diabetic retinopathy rat model with zinc group do not have statistical difference(P＞0.05).ConclusionWe think the supplemen of zinc have inhibition effect on VEGF expression,the supplemen of zinc have preventative and therapeutic effects on diabetic retina rat.

Diabetes;Retina;Zinc;VEGF

R587.1

A

1007-4287(2010)09-1375-03

吉林省科技厅应用基础研究200905137

董宇,硕士研究生导师,主要从事眼底病,眼外伤研究。

2009-11-27)