胶质瘤来源exosome的鉴定及其蛋白质组成研究

金 铮,于金录,杨 ,李 超,黄海燕

(吉林大学第一医院神经外科,吉林长春 130021)

胶质瘤来源exosome的鉴定及其蛋白质组成研究

(吉林大学第一医院神经外科,吉林长春 130021)

目的初步分析胶质瘤细胞分泌的exosome蛋白组成,探讨胶质瘤来源exosome的潜在免疫调节功能,从而为进一步利用exosome对胶质瘤进行免疫治疗提供理论依据。方法采用差速离心法从U251胶质瘤细胞培养上清液和Ⅲ级星形胶质瘤囊液中分别提纯exosome,用透射电镜鉴定;利用二维电泳分离、分析exosome内蛋白质,并用质谱技术鉴定了部分蛋白质。结果胶质瘤细胞可以产生exosome,其平均直径约100 nm。二维电泳图显示U251细胞分泌的exosome含有270个蛋白点,与数据库相符的有66个;而来自Ⅲ级星形胶质瘤囊液的exosome含有242个蛋白点,与数据库相符的有60个;两者有130个蛋白点在等电点和表观分子量方面相同,其中包含HSP70、RNA结合蛋白、核酸外切酶、MHCI及MHCII类分子等。部分蛋白质点质谱鉴定结果为hCG、低密度脂蛋白、T细胞受体等。结论胶质瘤细胞可分泌exosome,其一般特性与已报道的exosome一致,其蛋白组成与其他细胞来源的exosome具有共性,体内和体外培养的胶质瘤细胞分泌的exosome的蛋白质组成具有同源性与差异性。胶质瘤细胞源的exosome具有一定的免疫调节功能,可以为胶质瘤免疫治疗提供理论基础。

exosome;胶质瘤;蛋白质组学;双向凝胶电泳;质谱

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1386)

Exosome起源于细胞内晚期核内体(late endosomes,LEs),即多泡体(multivesicular bodies,MVB)。Exosome似的小囊泡在多泡体内积聚,当多泡体的外膜与细胞质膜融合后,其内的小囊泡批量地释放到细胞外基质中,从而形成exosome。Exosome的功能根据来源细胞的不同而有所不同,其中肿瘤来源的exosome[1]是目前研究的热点,由于其携带肿瘤抗原,而且肿瘤细胞容易培养,因此它是一种理想的可能用于临床的exosome。在免疫系统中,exosome能够将外来抗原传递给T细胞,在免疫调节中发挥作用。它也可作为一种免疫治疗的新手段,应用在肿瘤治疗和免疫耐受等方面。

因此,关于exosome的蛋白质研究成为目前亟待解决的问题。本实验首次用双向凝胶电泳和质谱分析的方法对U251胶质瘤细胞培养上清液和Ⅲ级星型胶质瘤囊液中提纯的exosome的蛋白质进行分离并鉴定,为胶质瘤细胞来源exosome的功能研究提供理论依据,也为exosome应用于临床治疗打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

IPGphor等点聚焦电泳仪、图像扫描仪、恒温循环器、Image Master VDS扫描软件、image master 2D platinum Image Quant TL凝胶图谱分析软件(瑞典Amersham Pharmacia Biotech);PROTEAN II Xi Cell垂直电泳仪购自BIO-RAD公司。

固相 pH 梯度干胶条 pH3-10、SDS、DTT、Acr、IPG-Buffer等购自Amersham-Pharmacia公司;硫脲、无水醋酸钠、硝酸银等均为国产分析纯或色谱纯;水为MilliQ超纯水。

1.2 实验材料及来源 U251胶质瘤细胞购自中国科学院上海细胞库;Ⅲ级星形胶质瘤细胞囊液(胶质瘤患者囊液,吉林大学第一医院)。

1.3 实验分组

A组:U251胶质瘤细胞培养上清液;

B组:为对照组,DMEM培养液,无细胞成分。

C组:Ⅲ级星形胶质瘤细胞囊液(胶质瘤患者囊液);

1.5 蛋白样品制备

-80℃保存样品,临用前取出,以1∶10体积加入500 μ l裂解液,同时按照50∶1的比例加入cocktail蛋白酶抑制剂10 μ l;超声破碎组织,每次超5 s停15 s,至 样品完全 溶解为透 明 、澄 清 ;加 入 10 μ g◦μ l-1DNA、RNA 酶 5 μ l;冰浴 20 min;4℃ 14 000 rpm 高速离心20 min;吸取上清,分装,-80℃保存。

裂解液成分 :40 mmol◦L-1Tris-HCl、7 mol◦L-1尿素 、2 mol◦L-1硫脲 、4%CHAPS 、1%DTT 、1 mmol◦L-1EDTA。采用Bradford法测定蛋白质含量。

1.6 双向凝胶电泳

用IPGphor IEF System进行第一相等电聚焦,蛋白上样前离心2 min,上样100 μ g,用重泡胀液溶解,其中含 8 mol◦L-1尿素 、0.02%CHAPS 、0.02 mol◦L-1DTT 、0.05%IPG buffer,加入 800 μ l覆盖液 。 等电聚焦程序设置,见表1。

表1 等电聚焦程序设置

第一相等电聚焦结束后,迅速拿出胶条在SDS平衡液中平衡两次,摇床上振荡15 min×2,其中第一种平衡液中加入20 mmol◦L-1DTT,第二种平衡液中加入100 mmol◦L-1碘乙酰胺。

取出胶条在PROTEN II xi Cell上进行第二相垂直SDS-PAGE,用浓度为13%的聚丙烯酰胺凝胶分离。恒流40 mA 40 min、60 mA 5 h,直至溴酚蓝前沿到达玻璃板底部。

凝胶采用考马斯亮蓝染色。

1.7 图像分析

应用瑞典Amersham pharmacia Biotech公司的图像分析软件image master 2D platinum对结果进行分析。查阅exosome蛋白质数据库,具体操作为:登陆www.expasy.org,输入关键词 exosome,在 Swiss-Prot和TrEMBL中搜索结果。分别查阅蛋白质等电点及分子量,然后将TrEMBL结果同样本A所得结果进行比对。

1.8 胶内酶解和质谱分析

从2DE胶上切取差异蛋白点,用50 mmol◦L-1的NH4HCO3,(含5 mmol◦L-1CaCl2)配成 0.1 g◦L-1的溶液置于冰浴中;每管抽干的胶块中加入约10 μ l酶液让其胶块吸收,吸干后再加,置于冰浴中 45 min;胶块吸胀后将多余酶液吸去,再加入20 μ l不含酶的缓冲液覆盖,37℃过夜消化;酶解后上清液用Tip头移至另一新的EP管,剩下的胶用50 μ l萃取液(5%TFA:50%CAN=1∶1)萃取 2次,每次超声 10 min;合并萃取液冻干后备用。

制备好的样品用MALDl-TOF质谱分析。应用Mascot搜索引擎进行蛋白比对,结合NCB Inr和Swissprot数据库进行综合分析。

2 结果

2.1 双向凝胶电泳结果

经扫描共获得3幅双向凝胶电泳图像(图略)。经2DE分离蛋白组成,并用软件分析凝胶图谱后发现,exosome蛋白含量丰富,U251胶质瘤细胞分泌的exosome含有270个蛋白点;而Ⅲ级星形胶质瘤囊液源exosome含有242个蛋白点;两者有130个蛋白点等电点和表观分子量相同。胎牛血清仅有109蛋白点。

2.2 双向凝胶电泳结果分析

查阅蛋白质数据库,对 2DE结果进行分析。Swiss-Prot中有99个结果,TrEMBL中有212个结果。分别查阅其等电点及分子量,将TrEMBL结果同样本A、C组所得结果进行比对,exosome蛋白含量丰富,U251胶质瘤细胞分泌的exosome含有270个蛋白点,与数据库相符的有66个;而Ⅲ级星形胶质瘤囊液源exosome含有242个蛋白点,与数据库相符的有60个;两者有130个蛋白点等电点和表观分子量相同。 依次查询 HSP70、MHCI、MHCII、CT antigen 和VEGF,并与样本A、C所得结果进行对比,发现胶质瘤细胞源性exosome含有RNA结合蛋白、核酸外切酶、HSP70、MHCI及MHCII类分子。

2.3 质谱分析结果

分别选取U251细胞(图略)和Ⅲ级星型胶质瘤囊液(图略)的2DE考染的部分蛋白质做质谱分析,共鉴定出17个蛋白质:点6、7、11均被鉴定为低密度脂蛋白受体,点8被鉴定为E1-E2 ATPase,点9被鉴定为T细胞受体β链(TCRBV6S3J2S6 gene),点10被鉴定为真核翻译起始因子3,点12和14分别被鉴定为免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区,点37被鉴定为人免疫球蛋白g1Fc段的晶体结构,点13被鉴定为循环B细胞抗体重链可变区,点15被鉴定为维生素K环氧化物还原酶复合物1亚单位2号单体,点31被鉴定为1号染色体142位开放阅读框,点32被鉴定为甲状腺激素蛋白稳定物,点34被鉴定为HCG,点35被鉴定为核苷酸交换因子,点36被鉴定为维生素D结合蛋白前体,点38被鉴定为乙二醛酶结构蛋白4,点4、5、33均鉴定为一种假定蛋白,点30为一未命名蛋白。

3 讨论

本实验首次采用蛋白组学技术对胶质瘤源性exosome进行研究,通过双向凝胶电泳将胶质瘤源性exosome进行蛋白质分离,扫描制备凝胶图像,查阅蛋白质数据库,对电泳结果进行分析,查找出一些可疑蛋白质。并对部分蛋白点进行了质谱鉴定,确定了其蛋白质名称,从而为exosome的抗胶质瘤治疗提供基础理论依据。

通过双向凝胶电泳结果与exosome蛋白质数据库对比显示,胶质瘤细胞源性exosome含有HSP70、RNA结合蛋白、核酸外切酶、MHCI及MHCII类分子等。

细胞外的热休克蛋白70(Heat Shock Proteins70,HSP70)具有免疫调节功能,并且在激活天然免疫系统活性的过程中起重要作用。液相中的HSP 70可使单核细胞通过CD14依赖性信号通路分泌促炎症细胞因子[2,3];质膜上结合的HSP 70被确认为是由自然杀伤细胞调节的溶细胞作用的目的蛋白。而且,肿瘤细胞膜上HSP70表达度越高,肿瘤细胞被自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)杀伤的几率越大,抗肿瘤效果越明显[4,5]。另外,用液相HSP70与NK细胞共孵育后,可以进一步增强NK细胞的溶细胞活性,并促进IFN-γ的分泌。HSP70表面阳性的exosome也可以选择性激活NK细胞,使其迁移、增殖,并产生免疫反应[6]。肿瘤细胞源性的exosome携带了大量的具有免疫调节功能的热休克蛋白,可在不用探明具体肿瘤抗原的情况下,进行肿瘤免疫治疗。不同的实验证明,经HSP激活的免疫细胞可以消除不同的肿瘤,并且目前肾脏肿瘤和转移黑色素瘤的免疫治疗已进入三期临床试验。肿瘤细胞源exosome富于HSP70分子伴侣,有可能会成为肿瘤免疫治疗的新热点。

质谱鉴定的部分蛋白质为低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR),人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG),T细胞受体,E1-E2 ATPase,真核翻译起始因子,维生素K环氧化物还原酶复合体1(vitamin K epoxide reductase complex subunit 1,VKORC1)等。

LDLR广泛分布于肝、动脉壁细胞等全身各组织的细胞膜的表面。其主要功能是调节胆固醇的体内平衡[7]。近来有人发现许多肿瘤细胞的LDLR的表达量显著增高[8],因而考虑LDLR可作为抗肿瘤药物靶向给药的靶点。LDLR介导的靶向给药方式并不能获得完全的肿瘤细胞特异性,因为正常细胞也表达LDLR,动物实验表明,若事先用胆汁酸和甾体化合物处理动物可能会缓解这一矛盾[8]。因此对LDLR表达、功能及其影响因素的关注,已成为近年来研究的一大热点。

正常的hCG主要功能是维持妊娠黄体,使胚胎得以发育,从而维持到足月妊娠,胎儿得以分娩。近些年很多学者发现恶性肿瘤可以表达异位hCG,但机理尚未清楚,多数学者[9-11]认为这是由于成人细胞的胚胎基因的不完全抑制,当发生恶性转化时,静息的胚胎基因被激活而表达。肿瘤组织分布的一定浓度的分泌性hCG可能与肿瘤微环境的形成有一定的关系。虽然关于异位hCG与恶性肿瘤之间的关系已经有了较多的研究,然而国内尚未有胶质瘤分泌异位hCG的报道,我们此次研究通过质谱分析认为胶质瘤源性exosome中含有hCG家族蛋白。

胶质瘤来源的exosome在对抗胶质瘤的作用过程中能够起到一定的免疫调节作用。当然,除HSP70以外,exosome内还表达MHCI分子[12-14]、以及 B7[12,15]、ICAM[12,16]、CD40[12]等共刺激分子 ,这些分子的表达对于抗原提呈,增强免疫效应也起着举足轻重的作用[17]。但是,胶质瘤细胞来源的exosome蛋白成分复杂,具体在免疫治疗过程中起什么作用及效果,还有待于进一步的研究。

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Identification and research of protein composition of exosome from glioma cell

JIN Zheng,YU Jin-lu,YANG Si,et al.(Department of Neurosurgery,The First Hospital of Ji Lin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo preliminary analyse of protein composition of exosome secreted by glioma,to explore the potential immunoloregulationof exosome from glioma cell,so as to make further use of exosome treatment of provideing a theoretical basis for glioma immunotherapy.MethodsPurified exosome from the supernatant of culture fluid of U251 glioma cell and hydatid fluid of grade III astroglioma cell by differential centrifugation,identified by transmission electron microscopy;analysis the protein composition of exosome by 2DE,identified the protein composition of exosome by mass spectrometry.ResultsGlioma cell can secrete exosome,the average diameter of the exosome is about 100 nm.Two-dimensional electrophoresis diagram shows that the exosome secreted by U251 glioma cell containing 270 protein spots,whit 66 proteinspotsmatch the database;the exosome secreted byⅢgrade astrocytoma cyst fluid containing 242 protein spots,whit 60 protein spotsmatch the database;the isoelectric point and apparent molecularweight of 130 protein spots are identical of the two kinds exosome,which contains HSP70,RNA-binding protein,exonuclease,MHCI,MHCII and so on.Part of the protein spotsidentified by mass spectrometry results of hCG,low-density lipoprotein,T cell receptor and so on.ConclusionGlioma cells can secrete exosome,itsgeneral characteristics in line with the reported exosome,its protein composition is common with other cell secreted exosome,the protein composition of exosome which secreted by glioma in vivo and in vitro have homologous and variability.Exosome secreted by glioma has a potential immunoloregulation function,can provide a theoretical basis of glioma immunotherapy.

exosome;glioma;proteomics;2D-PAGE;mass spectrogram

R739.4

A

1007-4287(2010)09-1386-04

*通讯作者

2010-01-15)