59株大肠杆菌中整合子的研究

陆思静，管希周，王睿，梁志欣，刘又宁（1.辽宁医学院附属第一医院呼吸科，锦州市 11001；.解放军总医院军医进修学院，北京市 100853）

59株大肠杆菌中整合子的研究

陆思静1＊，管希周2，王睿2，梁志欣2，刘又宁2（1.辽宁医学院附属第一医院呼吸科，锦州市 121001；2.解放军总医院军医进修学院，北京市 100853）

目的：研究59株耐头孢西丁大肠杆菌整合子的分类、结构及其在介导耐药中的作用。方法：利用多重聚合酶链反应（PCR）方法检测整合酶基因（intI），对其阳性菌株可变区（Int）扩增产物进行测序分析；采用微量稀释法测定22种抗生素对试验菌株的敏感性。结果：59株大肠杆菌中，45株Ⅰ类整合酶基因阳性（76%）；所携带的耐药基因盒绝大多数为aadA5和dfr 17；仅有2株携带β-内酰胺酶耐药基因盒；整合子阳性组抑菌浓度明显高于阴性组。结论：Ⅰ类整合子广泛地存在于耐头孢西丁大肠杆菌中；耐药基因盒是整合子阳性菌株对氨基糖苷类、磺胺类药物及氯霉素耐药的主要原因，但对介导β-内酰胺类耐药方面，不起主要作用。

整合子；基因盒；细菌耐药；聚合酶链反应

大肠杆菌是引起下呼吸道感染最常见的革兰阴性杆菌之一[1]，随着多重耐药菌株的日渐增多，治疗该菌引起的感染变得越来越困难。其耐药机制非常复杂。研究表明，整合子不仅可介导细菌耐药性群聚，导致多重耐药性的产生，而且可以在不同遗传物质和菌种间转移，引起耐药基因高效快速转移，这已经成为研究热点[2]。但国内这方面的研究鲜见。整合子由5′-和3′-保守末端及中间的可变序列组成，5′-保守末端携带编码整合酶的基因（intI）、整合酶基因重组位点（attI）和一个启动子的基因片段。中间的可变区域携带有耐药基因的基因盒[3]。现已确认至少有9种整合子，但在耐药方面起最主要作用的为第1类整合子[4，5]。以解放军总医院临床连续收集的59株大肠杆菌为对象，对其耐药情况、整合子分布及其结构特征、整合子介导的耐药机制在多重耐药性中的作用进行研究，为指导临床合理应用抗生素，控制耐药菌株在院内的传播提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

解放军总医院微生物科从2001～2002年各种临床标本中分离得到的全部大肠杆菌719株。纸片琼脂扩散药敏试验筛选出对头孢西丁耐药菌株59株[6]。

1.2 主要试剂与仪器

DL15 000 DNA Marker为日本TaKaRa公司产品；pGEM-T载体、DNA聚合酶采用美国Promega公司产品；包被22种抗生素的96孔药敏板（天津金章医用新技术研究所）；DNA Thermal Cycler 2400为美国Perkin Elmer公司产品。

1.3 药敏试验方法

采用微量稀释法测定头孢西丁耐药的59株大肠杆菌对以下22种抗生素的最低抑菌浓度（MIC）：磺胺甲基异唑、萘啶酸、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、利福平、氯霉素、四环素、亚胺培南、环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉维酸。质控菌株为大肠杆菌ATCC25922。药敏判断标准按NCCLS 2004年版[7]的规定执行。数据统计时将中敏归于耐药分析。

1.4 整合酶基因的PCR检测

引物序列为IntIF：5′-TGC GGG TYA ARG ATB TKG ATT-3′，IntIB：5′-CAR CAC ATG CGT RTA RAT-3′，目的片段长度491 bp。PCR反应条件：94℃预变性10 min，然后进入循环94℃1 min，51℃30 s，72℃45 s，循环40次，最后72℃延伸10 min，在紫外灯下观察扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳中的分析结果，出现明显亮带的为初筛阳性。阳性条带行切胶纯化后分别用内切酶（HinfⅠ、AVaⅡ）行限制性片段长度多态性分析，选取酶切片段长度一致的PCR纯化产物测序，用Blast程序分析。

1.5 可变区基因盒PCR检测及DNA测序分析

引物序列为Int-F：CGG ATG AAG GCA GCA ACC CA，Int-R：AAG CAG ACT TGA CCT GAT AG。反应参数：94℃预变性5 min，94℃变性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸3 min，35个循环，最后一个循环72℃延伸7 min，4℃保护。在紫外灯下观察扩增产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳中的分析结果，阳性条带行切胶纯化，TA克隆，转化感受态细胞DH5a送北京奥科生物技术有限责任公司及上海基康生物技术有限公司进行测序，在Genbank比对。

1.6 统计学方法

根据整合子检测结果，将大肠杆菌分为整合子阳性组和阴性组。采用SPSS 11.52统计软件和χ2检验对整合子阳性组和阴性组菌株的药敏情况进行统计学分析。

2 结果

2.1 大肠杆菌中整合酶基因PCR检测及酶切测序结果

头孢西丁耐药的59株大肠杆菌中，45株均在500 bp左右出现了阳性条带，提示上述菌株携带了整合酶基因，阳性率为76%（45/59），结果见图1。整合酶基因PCR纯化产物的酶切及序列分析：PCR扩增产物经HinfⅠ酶切后进行电泳检测的结果是44个PCR产物均没有被消化，得到491 bp片段，整合酶基因PCR产物HinfⅠ酶切结果见图2。PCR产物未被切开，且保留原有的片段，证明这些菌株携带Ⅰ类整合子。用AvaⅡ对上述的PCR产物酶切，在146 bp和345 bp产生2个酶切片段，进一步证实为Ⅰ类整合子，整合酶基因PCR产物AvaⅡ酶切结果见图3。随机抽取的2个样品ECO03、ECO34测序，结果在Genbank上Blast为Ⅰ类整合酶。与AY463797比较序列符合率（identities）为100%。

图1 整合酶基因PCR结果电泳图M.2 000 bp DNAMarker；1～7均为实验菌株Fig 1 Electrophoretogram of PCR product of intIM.2 000 bp DNAMarker；1～7.strains

图2 整合酶基因PCR产物HinfⅠ酶切结果电泳图M.2 000 bp DNAMarker；1～8均为实验菌株Fig 2Electrophoretogram of intI PCR product digested with HinfⅠM.2 000 bp DNAMarker；1～8.strains

图3 整合酶基因PCR产物AvaⅡ酶切结果电泳图M.2 000 bp DNAMarker；1～10均为实验菌株Fig 3 Electrophoretogram of intI PCR product digested withAvaⅡM.2 000 bp DNAMarker；1～10.strains

2.2 Ⅰ类整合子可变区相关基因盒扩增结果

对45株Ⅰ类整合阳性菌株用可变区基因盒特异引物，扩增出的42个阳性PCR产物，根据片段大小分成3组：36株出现接近1 700 bp大小条带的为A组，切胶纯化后，用DraI和EcoRV双酶切，限制性片段长度多态性分析证实为同样片段；2株出现接近2 000 bp大小条带的为B组；2株出现接近2 500 bp条带为C组；2株出现大于2 500 bp条带为D组。整合子可变区特异性引物PCR扩增结果见图4。在A组中随机抽取4个，B、C、D组各2株分别进行测序和序列分析。A组片段大小为1 664 bp，其含有2个开放阅读框，大小分别为474 bp和789 bp，与耐药基因盒aadA5和dfr17都为100%同源，分别对氨基糖苷类抗生素壮观霉素、链霉素和磺胺类药物甲氧苄啶产生耐药，这4株所带基因盒完全一致，Genbank登陆号分别为AY748452和AY828551。B组PCR产物测序表明，其长度为1 913 bp，内部插入dhfrⅫ基因（编码二氢叶酸还原酶，对磺胺类耐药）和aadA2基因（编码氨基酰腺苷酰基转移酶，对氨基糖苷类耐药），序列符合率为100%，还有一编码功能不清楚的ORF5，Genbank登陆号AY748453。C组PCR产物测序表明，其长度为2 360 bp，经Blast比对在整合子可变区共有2个耐药基因盒：包括1个aacA4，产生氨基糖苷乙酰转移酶AAC（6′）-Ib（对壮观霉素、链霉素耐药）和cmlA1-variant基因（对氯霉素耐药）。与AB212941比较序列符合率为99%，有6个碱基的变异，不在读码框内为无意义突变，Genbank登陆号为AY912492。D组PCR产物经多次测序失败，ECO16用整合酶基因的前向兼并引物和TEM扩出的片段长度为1 467 bp，带有blaTEM-1b基因，对β-内酰胺类抗生素耐药，与tnpR基因相接，Genbank登陆号为DQ406736。另一株扩增的片段长度约为3 000 bp的ECO24，测序一端为Ⅰ类整合酶基因，另一端为blaTEM-1b基因，中间部分未能测通，仍在研究中。

图4 整合子可变区特异性引物PCR扩增结果电泳图M.15 000 bp DNA Marker；1～2为A组；3～4为B组；5～6为C组；7～8为D组Fig 4 Electrophoretogram for PCR product of specific primer in variable regions of integronsM.15 000 bp DNA Marker；1～2.group A；3～4.group B；5～6.group C；7～8.group D

2.3 整合子阳性菌株与阴性菌株耐药情况比较

对59株菌按整合子阴、阳性分为2组，对22种抗生素的MIC用多因素的方差分析显示，2组比较差异有统计学意义（P＝0.01），整合子阴性组抑菌浓度明显低于阳性组，见图5。对22种抗生素的MIC用单因素t检验，分析显示：在整合子阴性组，磺胺甲基异唑（SMZ）、庆大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、阿米卡星（AMK）、奈替米星（NET）、利福平（RIF）、氯霉素（CHL）、四环素（TET）抑菌浓度明显低于阳性组，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；亚胺培南、环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、头孢哌酮、替卡西林的抑菌浓度与整合子阳性组抑菌浓度相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

图5 整合子阳性菌株与阴性菌株耐药情况比较与整合子阴性组比较：*P＜0.05Fig 5 Comparison of drug resistance between integron-positive strains and the negative strains vs.integron-negative group：*P＜0.05

在研究中，我们以第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合酶基因的简并引物扩增整合酶基因作为整合子阳性菌株的筛选。实验显示，整合子检出率76%，远远高于其他国家或地区的平均水平50%左右[8]，可能因为：（1）实验样本均为分离自患者的药敏测试中具有多重耐药表型的高耐药菌；（2）由于有的第Ⅰ类整合子具有不完整的3′-保守端[9]，在实验设计上，简并引物可同时检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子的分布，可防止以3′-保守端扩增结果作为整合子阳性菌株的检出方法所造成漏检。45株整合酶基因阳性片段经测序和酶切证实均为Ⅰ类整合子，与一些报道[10]一致。

研究表明，整合子阳性组抑菌浓度明显高于阴性组，主要在磺胺类药物、四环素、氯霉素及氨基糖苷类，而2组其它药物比较差异无统计学意义。进一步研究发现：整合子所携带与耐药基因盒主要是aadA5和dfr17，aacA4和cmlA1，分别对氨基糖苷类抗生素壮观霉素、链霉素、磺胺类药物甲氧苄啶及氯霉素耐药。说明整合子携带的耐药基因盒是整合子阳性菌株对氨基糖苷类、磺胺类药物及氯霉素耐药的主要原因。国外许多研究也发现编码对链霉素、壮观霉素和甲氧苄啶的耐药性的基因盒常见，但是最常见的是dhfr1-aadA1基因盒组合[11]。

尽管有大量报道β-内酰胺类基因盒是整合子最常携带的基因盒之一，但本研究仅发现2株细菌整合子携带β-内酰胺酶耐药基因盒，与报道[12]不一致。提示，在本研究的59株大肠杆菌中，耐药基因盒在介导β-内酰胺类抗生素耐药方面，不起主要作用。值得注意的是，整合子中已经携带有β-内酰胺酶耐药基因盒，尽管很少，也应引起足够重视。因为细菌自身染色体上的整合子-耐药基因盒可通过复制传递给下一代，即垂直传播，而整合在质粒上的则可在同菌属甚至不同菌属间水平传播。

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Study on Integron in 59 Strains of Escherichia Coli

LU Si-jing（Dept.of Respiratory，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）
GUAN Xi-zhou，WANG Rui，LIANG Zhi-xin，LIU You-ning（Chinese PLA Postgraduate Medical School，Beijing 100853，China）

OBJECTIVE：To investigate the classification，structure and inducing drug resistance of integron in 59 strains of cefoxitin-resistantEscherichia coli.METHODS：PCR method was used to detect integrase gene（intI）and product of variable region of positive strain was performed on sequencing.Sensitiveness of experimental strains to 22 kinds of antibiotics was detected with microdilution method.RESULTS：IntI1 was identified in 45 strains（76%）of the 59 strainsEscherichia coli.The most drug resistance genes cassettes were aadA5 and dfr17，only 2 strains encoding β-lactamase drug resistance gene cassettes.The MIC of integron positive groups was statistically significantly higher than negative groups.CONCLUSION：Class 1 integron resided in cefoxitin-resistantEscherichia coliwidely.The cause of drug resistance of integron positive strain to aminoglycosides，sulfonamides and chloramphenicol is drug resistance gene cassettes.Gene cassettes does not play important role in integron-mediated drug resistance.

Integron；Gene cassettes；Drug resistance；PCR

R378.2+1；R969.3

A

1001-0408（2010）10-0901-04

2009-12-06

2010-01-24）