聚球藻hox1基因的克隆和序列分析

张 茜,臧晓南,张学成＊＊,赵炳然,袁定阳,唐 俐

(1.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;2.国家杂交水稻工程技术研究中心,湖南长沙410125)

聚球藻hox1基因的克隆和序列分析

张 茜1,臧晓南1,张学成1＊＊,赵炳然2,袁定阳2,唐 俐2

(1.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;2.国家杂交水稻工程技术研究中心,湖南长沙410125)

本实验应用降落PCR方法从聚球藻S ynechococcus cedrorum中扩增出717bp的hox1基因全序列,并与从Gen-Bank下载13个蓝藻hox1基因序列比较,用MEGA4.0进行序列同源性分析及蛋白结构特性分析。结果表明,S ynechococcus cedrorum的hox1基因与聚球藻S ynechococcusPCC7942和钝顶节旋藻A rthrospira platensis的hox1基因序列同源性分别为99.9%和99.2%,氨基酸序列同源性分别为99.6%和97.9%。还用邻接法和最大简约法构建了系统树并进行了聚类分析。

聚球藻;hox1基因;亚铁血红素氧化酶Ⅰ;聚类分析

在红藻、蓝藻和隐藻的光合系统中,藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是吸收光能和传递激发能的捕光色素蛋白[1]。与叶绿素、细菌叶绿素和胡萝卜素等其它光合色素不同,与藻胆蛋白结合的藻胆素(Phycobilin)是一类线性四吡咯化合物,并在相应的裂合酶催化下以共价键—硫醚键与之连接,藻胆蛋白才具有光能传递活性。蓝藻中有4种藻胆素,分别为藻红胆素(Phycoerythrobilin),藻蓝胆素(Phycocyanobilin)、藻尿胆素(Phycourobilin)和藻紫胆素(Phycoviolobilin),它们是同分异构体,基本化学结构相同[2-4]。藻蓝胆素来源于血红素Ⅸ,血红素Ⅸ被氧化而共轭环断裂形成胆绿素IV,这一过程是在亚铁血红素氧化酶Ⅰ(Heme oxygenase1,hox1)催化下完成的,胆绿素IV在藻蓝胆素合成酶PcyA的催化下形成藻蓝胆素[5-7]。Cornejo克隆了集胞藻S ynechocystissp.PCC6803的hox1基因,并在大肠杆菌中得到成功表达[8]。Tooley等[9-10]用集胞藻S ynechocystissp.PCC6803的4个关键酶基因(hox1,pcyA,cpcE,cpcF)和C-藻蓝蛋白α亚基基因(cpcA)构建了2个表达质粒并表达出C-藻蓝蛋白a亚基的光能传递功能。因为藻蓝蛋白具有荧光性、抗氧化生物活性和抗敏性,它被当作天然色素蛋白、食品优质蛋白添加剂、理想的光敏剂越来越广泛地应用于食品化妆品、医疗诊断及生物工程领域。具有光能传递活性的藻胆蛋白的相关研究受到重视[11-12],其中与藻蓝胆素的合成相关的hox1基因的克隆与序列分析也是一个重要的环节。

PCR作为1种体外扩增DNA的方法,目前在生物医药领域中应用越来越广泛。影响PCR的因素很多:PCR仪器性能、反应体系、反应条件,其中退火温度影响最大。在实验中经常出现2种情况:一种是因未找到最佳扩增条件导致产生大量非特异性产物;另一种情况是未扩增出任何产物。降落PCR(Touchdown PCR,TD-PCR)是对PCR方法的优化,编设一系列退火温度从较高温度开始逐步降低的循环反应程序,获得理想的扩增效果[13-15]。本文用降落PCR方法从聚球藻S ynechococcus cedrorumFACHB283总DNA中首次克隆了hox1基因,并对其进行了序列分析。继而引用NCBI上已报道的hox1基因的序列信息,对蓝藻的hox1基因进行了系统进化分析,以期为利用大肠杆菌、酵母等成熟的表达系统乃至高等植物的表达系统大规模生产具有光学活性的藻胆蛋白方面的研究提供分子生物学资料。

1 材料和方法

1.1 材料

聚球藻藻株S ynechococcus cedrorumFACHB283由本实验室提供;PCR所用反应试剂购自Takara公司,E.coliDH5α由本实验室保藏,pMD18-T Simple Vector购自Takara公司,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根公司;PCR扩增采用BIO-RAD PCR仪,阳性重组子送到博尚生物技术有限公司测序。

1.2 方法

1.2.1 培养 聚球藻的培养基为BG-11培养基。培养条件为25℃,光强为40μmol·m-2·s-1,光周期(12L/12D),接种密度为0.3(OD560),4 d左右生长至对数生长期,更换一次培养基,继续培养4 d左右,离心(8 500 r/min;6 min)收集藻体。

1.2.2 DNA的提取 DNA的提取采用改良的CTAB法[16]。取200 mg微藻样品置于1.5 mL的离心管中,加600μL CTAB缓冲液(2%CTAB,1.4 mol/L NaCl, 50 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris·HCl pH=8.0, 2%β-巯基乙醇),混匀,于65℃水浴保温1 h。取出后加等体积PCI抽提液(苯酚氯仿异戊醇=25∶24∶1),混匀10 min,用Eppendorf 5417R型离心机于4℃, 12 500 r/min离心10 min。将上清液转至新的离心管中,加入RNaseA(200μg/mL)至终浓度为1μg·mL-1,在37℃下放置30 min。再用PCI抽提液抽提1次。水相转至新的离心管中,加入2倍体积无水乙醇,室温下放置0.5 h,沉淀DNA。于4℃及12 500 r/min条件下离心15 min。弃去上清液,用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次,晾干,将DNA溶解于20μL TE缓冲液中。

1.2.3 hox1基因的克隆 根据已报道的蓝藻A rthrospiraplatensis和S ynechococcusPCC7942的hox1基因序列设计引物。

上游引物P1:5′-ATGGGCGCGAATCTA GCAACCA-3′

下游引物P2:5′-TTATTCGGCTGCAGTTGCTAACT-3′

PCR反应体系组成为:10×PCR反应缓冲液2 μL,25 mmol/L MgCl21.2μL,10 mmol/L dNTP 1.6 μL,10μmol/L的引物P1和P2各0.8μL,Taq酶0.5 U,模板DNA0.5μL,加ddH2O补足体系至20μL。

降落PCR反应循环条件为:预变性95℃,5 min; 94℃,30 s,47℃降到40℃,每次降1.0℃,1 min, 72℃,1 min,共14个循环;然后94℃,30 s,55℃,1 min,72℃,1 min,共20个循环;最后在72℃延伸8 min。

PCR扩增产物采用天根公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收,连接体系依据Takara连接试剂盒pMD18-T Simple Vector的使用说明进行。PCR检测法用通用引物M13筛选阳性重组子,博尚生物技术有限公司测序。

1.2.4 序列分析和系统树的构建 以克隆并测序得到的基因序列作为原始数据,用NCBI网站上的在线ORF finder进行开放阅读框预测,DNAMAN推导核酸序列对应的氨基酸序列。用蛋白分析软件EXPASY (http://www.expasy.ch/)中的SOPMA方法预测分析蛋白特性及可能的二级结构。利用MEGA4.0[17-18]对核酸序列和氨基酸序列进行比较。结合GenBank中蓝藻的hox1基因的核苷酸序列,采用MEGA4.0中的邻接法(Neighbor-joining method)和最大简约法(Maximum parsimony method)获得系统树,重复计算1 000次得到系统树拓扑结构的支持。

2 结果与讨论

2.1 hox1基因的PCR扩增结果

根据A rthrospiraplatensis和S ynechococcus PCC7942的hox1基因的序列信息,预测PCR所扩增的基因片段大小应为717 bp左右。将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图1,目的大小的条带清晰,目的大小条带附近没有杂带。

图1 聚球藻synechococcus cedrorum hox1基因的PCR产物电泳Fig.1 PCR product ofS ynechococcus cedrorum hox1 gene

2.2 hox1基因的测序及序列分析结果

PCR测序结果显示,从S ynechococcus cedrorum FACHB283中克隆得到的hox1基因的片段长度为717 bp(见图2)。

测序结果通过NCBI网站上的在线ORF finder预测,结果表明,最大开放阅读框从1-717bp(见图3)。

图2 聚球藻synechococcus cedrorum的hox1基因序列Fig.2 Sequence ofS ynechococcus cedrorum hox1 gene

图3 聚球藻S ynechococcus cedrorum的hox1基因的开放阅读框分析Fig.3 ORF analysis ofS ynechococcus cedrorum hox1 gene

hox1基因的GC含量分析结果表明(见表1): S ynechococcus cedrorum的GC含量为51.9%,在聚球藻各品系中偏低(49.3%～59.3%),与S ynechococcus PCC7942的GC含量极其接近。与其他藻种进行比较发现,S ynechococcus cedrorum的GC含量与钝顶节旋藻A rthrospira platensis和集胞藻S ynechocystissp. PCC6803的GC含量相差无几,它们分别为51.7%和50.5%。而较Cyanothece和N ostoc数值偏高。

表1 聚球藻S ynechococcus cedrorum及其他13种蓝藻hox1基因的碱基组成Table 1 Base composition ofS ynechococcus cedrorum hox1 gene and other 13 cyanobacteria

2.3 Hox1氨基酸序列分析结果

不同的物种具有明显的密码子偏性,导致密码子偏性的最主要因素是基因组的碱基偏好和对偏爱密码子的选择,其中蓝藻的选择作用较为强烈[24]。聚球藻S ynechococcus cedrorumFACHB283hox1的密码子使用情况列于表2。在核酸序列中,密码子的第3位碱基包括52个A,46个T,52个G和89个C。其中C的含量高达37.2%,T的含量最低为19.2%。基因表达水平的高低与密码子使用密切相关,并且高表达的基因强烈偏好使用以T或A结尾的密码子[25]。由此可以推测,聚球藻S ynechococcuscedrorum FACHB283的hox1基因非高表达基因。

分析聚球藻S ynechococcus cedrorumFACHB283 hox1的密码子使用情况可知GAA,GCC,GGC这3个密码子分别为13,12和11次。TGC和CAA分别编码100%的Cys和Gln,在编码Tyr的密码子中TAC约占81.8%。

表2 聚球藻S ynechococcus cedrorum的hox1基因的密码子使用情况Table 2 The coden usage ofS ynechococcus cedrorum hox1 gene

本文对所推导的蛋白质序列进行了蛋白质性质结构的网上分析(见图4),由该序列推导出的氨基酸序列的Mw=26 784.40 kDa,等电点为5.76,其蛋白质的不稳定系数为27.93,可认为是稳定的蛋白质。其二级结构分析表明:其中α螺旋(Alpha helix)69.33%,β转角(Beta turn)3.36%,延伸主链(Extended strand) 4.20%,随机卷曲(Random coil)23.11%。

图4 聚球藻Hox1的二级结构预测Fig.4 Prediction of secondary structure ofHox1 inS ynechococcus cedrorum

2.4 hox1基因序列同源性分析

对S ynechococcus cedrorum及NCBI已报道的12种蓝藻的hox1基因序列运用DNAMAN软件进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分析(见表3)。核苷酸序列同源性分析表明:聚球藻S ynechococcus cedrorum与其他蓝藻的hox1基因的序列相似性比较高,介于57.9%～99.9%之间。其中与聚球藻S ynechococcusPCC7942的相似性最高,达到99.9%,钝顶节旋藻A throspira platensis次之,相似度为99.2%,与蓝杆藻Cyanothecesp.PCC7424和念珠藻N ostocsp. PCC7120的相似度最低,为57.9%。氨基酸序列同源性分析:S ynechococcus cedrorum与S ynechococcus PCC7942的hox1基因的相似性最高(99.6%),与钝顶节旋藻Athrospira platensis的相似度次之(97.9%),与蓝杆藻Cyanothecesp.PCC7424和念珠藻Nostoc sp.PCC7120的相似度最低(54.1%)。

2.5 分子系统树的构建

在系统进化树的研究中,很难用1种系统进化树正确得出系统关系[26]。为此,本文基于hox1基因序列构建了2种进化树:NJ、MP树,均以集胞藻S ynechocystissp.PCC6803为外类群进行聚类分析。

表3 12种蓝藻的核苷酸序列(左下)及氨基酸序列(右上)的相似性Table 3 Similarity of nucleotide sequence(bottom-left)and amino acid sequence(top-right)ofhox1 gene in 12 cyanobacteria

在NJ树的构建中,“Bootstrap”进行1 000次以检验分枝的置信度。枝上数字为1 000次bootstrap分析的支持百分率,其数值越高,支持率越高,树的置信度越高。从图5的NJ树可以看到,聚球藻S yenchococcus cedrorum和S ynechococcusPCC7942及钝顶节旋藻A rthrospira platensis的亲缘关系很近,S ynechococcusWH7803和S ynechococcussp.CC9311相聚成姐妹种,这5个聚为一类。这些关系得到了较高的Bootstrap(68以上)的支持。念珠藻Nostoc PCC7120与他们聚为第二类,最后与蓝杆藻Cyanothecesp. PCC7425聚为一类。MP树与NJ树的聚类关系类似,不同的是蓝杆藻与念珠藻聚为了一类,再与聚球藻和钝顶节旋藻聚为一类。从系统树来看,同一亚科中的不同属间表现为同一属内的物种优先聚为一枝,且有很高的置信度,并与同一亚科内的其它属聚在同一亚科下,构成同一亚科下的姐妹群,NJ树和MP树均表现出上述规律,说明所构建的分子系统树具有一定的可靠性。2种方法构建的分子系统树中,螺旋藻亚科的钝顶节旋藻与聚球藻所在的聚球藻亚科聚为一类,鉴于作者现在所能获得的螺旋藻属的hox1基因序列有限,螺旋藻与聚球藻的亲缘关系远近还需要更多的生物信息学资料来做进一步分析和论证。

图5 8种蓝藻hox1基因序列NJ树(上)和MP树(下)Fig.5 NJ tree(above)and MP tree(below)based on thehox1 gene sequence in 8 cyanobacteria species

本试验中的NJ树和MP树反映的情况略有差别,这可能有两方面的原因:其一,与NJ法和MP法本身的原理有关。MP法用的假设较少,在预测远缘序列的关系时准确度低,这也说明所选取的几种蓝藻的亲缘关系跨度较大;其二,与所选的物种种类、数量有关。因此,作者认为在进一步的研究中,应增加用于分析的种属分类单元的种类与数量,从而得出更准确的结论。

3 结语

本文首次报道了聚球藻S yenchococcus cedrorum FACHB283的hox1基因序列,该基因全长717 bp,编码238个氨基酸和1个终止密码子。其GC含量为51.9%。蛋白质结构特性分析显示该基因编码的蛋白为稳定蛋白。序列同源性分析结果表明:S ynechococcus cedrorum的hox1基因与聚球藻S ynechococcus PCC7942和钝顶节旋藻A rthrospira platensis的hox1基因序列同源性分别为99.9%和99.2%,氨基酸序列同源性分别为99.6%和97.9%。用邻接法和最大简约法构建的系统树分析表明,S ynechococcus cedrorum与S ynechococcusPCC7942和A rthrospira platensis的亲缘关系较近。

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Abstract: The completehox1 gene including 717bp was cloned fromS ynechococcus cedrorumby using touchdown PCR technology.Homology analysis based on cyanobacteria hox1 gene showed that the similarity is 99.9%betweenS ynechococcus cedrorumandS ynechococcusPCC7942 and 99.2%betweenS ynechococcus cedrorumandA rthrospira platensis.The similarity of deduced amino acid is 99.6%(between S ynechococcus cedrorumandS ynechococcusPCC7942)and 97.9%(betweenS ynechococcus cedrorumand A rthrospira platensis)respectively.The phylogenetic relationships among eight cyanobacteria were constructed by the methods of neighbor-joining(NJ)and maximum parsimony(MP).

Key words: S ynechococcus;hox1 gene;heme oxygenase1;phylogenetic analysis

责任编辑 于 卫

Cloning and Sequence Analysis of hox1 Gene from Synechococcus cedrorum

ZHANG Qian1,ZANG Xiao-Nan1,ZHAN G Xue-Cheng1,ZHAO Bing-Ran2,YUAN Ding-Yang2,TANG Li2
(1.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.China National Rice Hybride R&D Center,Changsha 410125,China)

Q75

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-110-07

国家转基因生物新品种培育重大专项项目(2008ZX08001-004)资助

2010-04-19;

2010-05-24

张茜(1984-),女,硕士。E-mail:qian0606@126.com

E-mail:xczhang@ouc.edu.cn