曲霉T3-5-1产单宁酶培养条件优化

林健辉，黄曼曼，陈雪香，王 征，肖苏尧，曹 庸,*

曲霉T3-5-1产单宁酶培养条件优化

林健辉1，黄曼曼1，陈雪香1，王 征2，肖苏尧1，曹 庸1,*

(1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510640；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

以通过60Co诱变得到的曲霉T3-5-1为实验菌株，通过单因素与正交试验，对其产单宁酶的条件进行研究。结果表明：以β-环糊精为碳源、蛋白胨为氮源、培养基初始pH值为5.5、单宁酸质量分数为3.5%、接菌量为5%、摇瓶培养转速120r/min、250mL三角锥瓶中装液50mL培养基、培养温度30℃的培养条件为曲霉T3-5-1的最佳产单宁酶条件。在此条件下，曲霉T3-5-1产单宁酶比活力达到202.16U/mL，比优化前提高约4倍。

曲霉；单宁酶；条件优化

单宁酶(EC3.1.1.20)全称单宁酰基水解酶(tannin acyl hydrolase)，为胞内酶，在黑曲霉、米曲霉及酵母等微生物中均已经发现，是一种诱导酶[1-6]。单宁酶用途广泛，既可以水解五倍子单宁生成没食子酸，也可以催化没食子酸和丙醇合成没食子酸丙酯[7]；它还能水解茶叶中的酯型儿茶素制备儿茶素单体。另据报道，单宁酶还可作为食品添加剂和用于开发茶饮料等[8]。在茶饮料生产过程中，主要存在有三大技术难点：浑浊沉淀的产生、汤色的褐变[9]和香气的恶化。其中，浑浊沉淀的产生是最关键的问题所在[10]。在茶饮料生产过程中，由于茶汤中多酚类、咖啡碱、蛋白质等通过分子间氢键与疏水作用形成络合物，可在低温时沉淀，形成“冷后浑”。沉淀的出现，严重影响了茶饮料的感官品质和可溶物总量，因此需要采用物理、化学[11]或酶法来解决。单宁酶作为酶促专溶酶，能断裂儿茶酚与没食子酸之间的酯键，使苦涩味的酯型儿茶素水解，释放出的没食子酸阴离子又能与茶黄素、茶红素竞争咖啡碱，形成分子质量较小的水溶性短链物质，从而降低茶汤的浑浊度[12-13]。

近年来，随着茶饮料工业的迅猛发展，单宁酶的研究日益受到各国的关注和重视。目前，单宁酶的产量不高，因此，大量的研究工作都是围绕如何提高单宁酶的产量展开的。本研究以通过60Co诱变得到的曲霉T3-5-1为出发菌，对其产单宁酶的条件进行研究，旨在提高单宁酶的酶活力，为今后制备单宁酶提供更优化的产酶条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

曲霉菌株T3-5-1由华南农业大学食品学院天然活性物研究中心在五倍子中分离并经60Co辐照诱变筛选得到。

1.1.2 试剂

没食子酸丙酯、单宁酸、蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸铁、硫酸镁溴酚蓝、柠檬酸、柠檬酸钠均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

斜面培养基(g/L)：蔗糖30、硝酸钠3、磷酸氢二钾1、氯化钾0.5、硫酸铁0.01、硫酸镁0.5；基础发酵培养基(g/L)：单宁酸20、蔗糖10、硝酸钠3、磷酸氢二钾1、氯化钾0.5、硫酸铁0.01、硫酸镁0.5。

1.2 仪器与设备

SE-CJ-27-D超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；恒温摇床 沈阳龙腾电子有限公司；手提式高压灭菌锅 滨江医疗设备厂；紫外-可见分光光度计 上海科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 曲霉T3-5-1的摇瓶发酵培养

将曲霉T3-5-1接种于斜面培养基斜面上，30℃培养，待孢子成熟后，用适量的生理盐水将孢子洗下于装有玻璃珠的三角锥瓶中，30℃振荡培养1～2h，使孢子充分分散。取1mL孢子悬液进行梯度稀释并镜检计数[14]，调整孢子密度至106个/mL。

在250mL的锥形瓶中装入50mL基础培养基，接种1mL曲霉孢子悬液于30℃，120r/min振荡培养72h。

1.3.2 单宁酶的提取及酶活力测定[15]

1.3.2.1 粗酶液的提取

发酵悬浮液经滤纸过滤后得到菌丝体。蒸馏水洗至pH值中性，于冰箱中预冷。将菌丝体、石英砂、0.1mol/L pH5.0柠檬酸缓冲液按1:1:4(m/m/V)的比例在冰浴下研磨成浆，0～4℃下10000r/min离心30min。取上清液，用缓冲液定容至10mL，即得单宁酶粗酶液。

1.3.2.2 单宁酶活力的测定

准备1支对照管、1支空白管和3支测定平行管。首先在每支试管中各加入0.2mL酶液，然后在测定管中各加入0.2mL底物没食子酸丙酯标准溶液(2×10-3mol/L)，在空白管中加入0.2mL 0.1mol/L pH5.0柠檬酸缓冲液，在对照管中加入0.6mL无水乙醇，准确反应20min后，分别在测定管和空白管中加入0.6mL的无水乙醇(终止测定管中的反应)，在对照管中加入0.2mL底物没食子酸丙酯标准溶液。待反应液冷却后，再分别在各支试管中加入9mL缓冲液稀释，测定波长270nm下吸光度。单宁酶酶活力的定义：反应温度45℃，pH5.0的条件下，酶液每小时水解减少0.01μmol底物没食子酸定义为一个酶活力单位(U)。

1.3.3 产酶发酵条件的单因素试验

1.3.3.1 不同质量分数单宁酸对单宁酶比活力的影响

50mL基础发酵培养基中的单宁酸分别配制成1%、2%、3%、4%、5%，其余组分不变，接种1mL曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养72h，测定单宁酶比活力。

1.3.3.2 不同种类碳源对单宁酶比活力的影响

50mL基础发酵培养基中的蔗糖分别替换成等质量分数的葡萄糖、β-环糊精、淀粉、麦芽糖，其余组分不变，接种1mL曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养72h，测定单宁酶比活力。

1.3.3.3 不同种类氮源对单宁酶比活力的影响

50mL基础发酵培养基中的硝酸钠分别替换成等质量浓度的硝酸铵、蛋白胨、豆饼粉、玉米粉，其余组分不变，接种1mL曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养72h，测定单宁酶比活力。

1.3.3.4 培养基不同初始pH值对单宁酶比活力的影响

50mL基础发酵培养基的初始pH值分别调成4、5、6、7、8，其余组分不变，接种1mL曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养72h，测定单宁酶比活力。1.3.3.5不同培养温度对单宁酶比活力的影响

50mL基础发酵培养基中接种1mL曲霉孢子悬液，120r/min振荡培养，分别控制温度25、28、30、33、35℃，72h后测定单宁酶比活力。

1.3.3.6 不同溶氧量对单宁酶比活力的影响

在菌种摇瓶发酵培养过程中，可通过改变培养基的装液量和摇床转速来控制摇瓶中的溶氧量。分别在装有30、40、50、60、70mL的基础发酵培养基中接种1mL曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养72h，测定单宁酶比活力。

装有50mL的基础发酵培养基中接种1mL曲霉孢子悬液，30℃摇瓶发酵培养，转速分别控制在100、120、140、160、180r/min，72h后测定单宁酶比活力。

1.3.3.7 不同接种量对单宁酶比活力的影响

50mL基础发酵培养基中接种量为3%、4%、5%、6%、7%，30℃、120r/min振荡培养72h，测定单宁酶比活力。

1.3.4 产酶发酵条件的正交试验

在单因素试验的基础上，选择对产酶影响较大的各个因素，进行正交试验，综合分析各个因素及其交互作用对产酶发酵的影响，进而确定最优发酵条件。

2 结果与分析

2.1 不同单宁酸质量分数对单宁酶比活力的影响

图1 不同单宁酸质量分数对曲霉T3-5-1产单宁酶的影响Fig.1 Effect of tannic acid concentration on tannase production

单宁酶是诱导酶，因此在产单宁酶发酵培养基中必须加入适当的诱导物单宁酸。由图1可知，当诱导物单宁酸的质量分数为3%时，单宁酶活力最大，为62.33U/mL。

2.2 碳源对单宁酶比活力的影响

图2 不同碳源对曲霉T3-5-1产单宁酶的影响Fig.2 Effect of carbon source type on tannase production

如图2所示，β-环糊精作为碳源可使酶比活力达到最大值116.51U/mL。其他4种碳水化合物所对应的酶活力均低于此最大酶比活力，使用蔗糖作为碳源的基础培养基使酶比活力达到50.24U/mL。

2.3 氮源对单宁酶比活力的影响

图3 不同氮源对曲霉T3-5-1产单宁酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen source type on tannase production

如图3所示，与硝酸钠作为氮源相比，无机氮源中硝酸铵表现出较低的单宁酶比活力(31.65U/mL)；有机氮源中，蛋白胨表现的单宁酶比活力则显著提高(80.98U/mL)。

2.4 初始pH值对单宁酶比活力的影响

图4 初始pH值对曲霉T3-5-1产单宁酶的影响Fig.4 Effect of medium initial pH on tannase production

如图4所示，培养基初始pH6时，酶比活力可达到最大值47.65U/mL。当初始pH值过高(pH7～8)时，菌株产酶能力则受到比较大的抑制。

2.5 培养温度对单宁酶比活力的影响

图5 不同培养温度对曲霉T3-5-1产单宁酶的影响Fig.5 Effect of culture temperature on tannase production

温度对发酵产酶过程的影响主要表现在对菌丝生长和代谢途径中各种酶活性的影响。如图5所示，当温度控制在30℃时，酶比活力达最大值46.54U/mL。

2.6 溶氧量对单宁酶比活力的影响

图6 不同装液量对曲霉T3-5-1产单宁酶的影响Fig.6 Effect of medium volume contained in 250 mL shaking flask on tannase production

如图6所示，当转速(120r/min)恒定，250mL三角瓶装液量为50mL时，单宁酶比活力最大值可达45.50U/mL；如图7所示，当装液量(50mL)恒定，转速在120r/min时，获得酶比活力最大值47.03U/mL。

图7 不同摇床转速对曲霉T3-5-1产单宁酶的影响Fig.7 Effect of rotational speed of shaking flask on tannase production

2.7 不同接种量对单宁酶比活力的影响

图8 不同接种量对曲霉T3-5-1产单宁酶的影响Fig.8 Effect of inoculum size on tannase production

如图8所示，当接种量达到5%时，单宁酶比活力达到最大，为97.32U/mL。

2.8 曲霉产酶条件优化的正交试验

表1 各单因素方差分析Table 1 Analysis of variances for tannase production with eight different culture conditions

对各单因素试验进行方差分析，结果如表1所示，单宁酸质量分数、碳源、氮源、初始pH值、以及接种量这5个因素对曲霉T3-5-1产单宁酶活力具有极显著影响，因此选择这5个因素，每个因素选择4个水平进行L16(45)正交试验。正交表设计见表2。

表2 L16(45)正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design

表3 产酶发酵条件的正交试验结果Table 3 Orthogonal array design layout and experimental results

由表3所示，5个因素影响曲霉T3-5-1产单宁酶能力的主次顺序为碳源＞氮源＞单宁酸质量分数＞pH值＞接种量，最优正交组合为A2B2C3D2E3，即以蛋白胨为氮源、以β-环糊精为碳源、培养基初始pH5.5、单宁酸质量分数为3.5%、接种量为5%。

2.9 验证实验

碳源为β-环糊精、氮源为蛋白胨、培养基初始pH 5.5、单宁酸质量分数为3.5%、接种量为5%，摇瓶培养转速120r/min，250mL三角锥瓶中装液50mL培养基，培养温度30℃，在此条件下，曲霉T3-5-1产单宁酶比活力达到202.16U/mL。

3 结 论

本实验室从植物五倍子中分离出一株产单宁酶的曲霉，然后利用60Co辐照诱变得到一株高产单宁酶菌株T3-5-1。通过单因素试验和L16(45)正交试验对其产酶条件进行优化，结果表明，单宁酶的诱导物单宁酸的质量分数、接种量、培养基初始pH值对菌株产单宁酶活力有很大影响。而溶氧量对菌株产酶活力的影响并不大；此外温度的影响也不大。菌株T3-5-1利用的碳源、氮源比较广泛，其中碳源以β-环糊精最好，氮源以蛋白胨最佳。参考有关单宁酶产酶条件的研究[14-15]发现曲霉基本上都倾向于使用植物氮源豆饼粉，但本实验中的曲霉T3-5-1却倾向于使用动物性氮源蛋白胨，这与前人的研究结果有所不同；而在碳源的使用上，曲霉T3-5-1倾向于利用可溶性淀粉β-环糊精，也与前人的研究结果不同，这说明不同来源的曲霉，其最优产酶条件并不完全一样。因此对此诱变菌株T3-5-1进行菌种鉴定，以及对其所产的单宁酶进行分离纯化及酶学性质研究，比较其与传统单宁酶是否存在差异，是下一步研究的方向。通过培养条件优化，单宁酶比活力达到202.16U/mL，比优化前提高约4倍。

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Optimization of Culture Conditions for Producing Tannase by Aspergillus sp.T3-5-1

LIN Jian-hui1，HUANG Man-man1，CHEN Xue-xiang1，WANG Zheng2，XIAO Su-yao1，CAO Yong1,*
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510640, China；2. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The conditions for producing tannase by a strain of Aspergillus sp.T3-5-1, which was derived from60Co-induced mutation, were optimized using single factor and orthogonal array design methods. The optimal carbon source, nitrogen source, medium initial pH, tannic acid concentration, inocumlum size, rotational speed of shaking flask, medium volume contained in 250 mL shaking flask and culture temperature were β-cyclodextrin, peptone, 5.5, 3.5%, 5%, 120 r/min, 50 mL /250 mL and 30 ℃, respectively. The maximum tannase activity was up to 202.16 U/mL under these conditions, approximately 4-fold higher than before optimization.

Aspergillus；tannase；optimization of culture conditions

TQ925

A

1002-6630(2010)19-0245-05

2009-12-23

林健辉(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：jianhuilcn@126.com

*通信作者：曹庸(1966—)，男，教授，博士，研究方向为天然活性物的提取、分离纯化。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn