高效液相色谱法同时测定榨菜中的10种食品添加剂*

黄海龙 庄 莉 崔 群 孙伟强

(桐乡市产品质量监督检验所，桐乡 314500) (桐乡市计量检定测试所，桐乡 314500)

高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分析分离技术,它是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，采用高压输送流动相和高灵敏度检测器,发展而成的现代液相色谱分析方法, 具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化高和应用范围广等特点[1]。

近年来，由于消费者对食品的安全性日益关注，食品中的各种添加剂越来越受到人们的重视。食品添加剂是指为了改善食品品质和色、香、味，以及为防腐和加工工艺的需要而加入食品中的化学合成或天然物质。在目前所使用的添加剂中，绝大多数为化学合成添加剂，它们是通过氧化、还原、缩合等一系列化学合成反应所得，有的具有一定毒性，有的在食品中起变态反应或转化成其它有毒物质。通过动物实验证明，有些物质有致癌、致畸形等作用，如果不加以限制使用，将对人体健康产生危害。

高效液相色谱具备分离效果好、灵敏度高和重现性好等优点,因此是目前食品添加剂定性、定量分析的首选方法[2]。笔者采用甲醇-乙酸铵 (0.02 mol/L)为流动相经梯度淋洗,能在25 min内将榨菜中的合成着色剂[3]、防腐剂[4,5]、甜味剂[6]等完全分离。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1100 型，美国安捷伦公司；

紫外可见光检测器：UV-2102PC型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

pH计：Delta 320型，瑞士梅特勒托利多科学仪器有限公司；

超声清洗机：CQ250型，上海申浦超声设备厂；

标准储备液：苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、糖精钠、乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)、天门冬酰苯丙胺酸甲酯(阿斯巴甜)、柠檬黄、日落黄浓度均为1 mg/mL；

标准混合液：取各组分标准储备液各0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，混合均匀后定容至10 mL，得到0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL系列标准混合使用液，备用。

1.2 样品处理

选择市售本地和外地产榨菜3种(胖子榨菜、航空小菜、乌江三榨)整包带汁切碎匀浆后,取样10 g左右装入125 mL三角烧杯中,加入5 mL 10 g/L乙酸锌溶液、50 mL蒸馏水混和均匀后超声波提取15 min，经中速定性滤纸过滤至100 mL容量瓶中,用氨水溶液(1+9)调节至pH 6.0,以蒸馏水定容至100 mL，经0.45 μm水相滤膜过滤后，供上机测定。

1.3 色谱条件

C18柱颗粒度：5 μm；柱温：30℃；检测波长：230 nm；流动相：甲醇-乙酸铵(0.02 mol/L)，体积比35∶65，pH 6.0，流速为1.0 mL/min；自动进样器进样量：5 μL；以保留时间定性，面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长选择

在200～300 nm范围内,用紫外-可见光分光光度计检测山梨酸、苯甲酸、糖精钠、乙酰磺胺酸钾、天门冬酰苯丙胺酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸、柠檬黄、日落黄10种物质,发现其敏感波长分别大致为260、229、202、226、254、254、254、231、257、234 nm。兼顾10种组分在200～300 nm的紫外吸收值，其中有4种物质的吸收峰值在230 nm附近,因此选择230 nm为起始检测波长，后期利用可变波长检测器的波长切换功能将扫描波长变更为254 nm，以达到不同波长吸收范围的物质都能有较大响应值[7]。

2.2 流动相选择

以甲醇-乙酸铵(0.02 mol/L)体积比为5∶95,pH 7,作为流动相对组分进行分离,结果如图1。

0—溶剂; 1—乙酰磺胺酸钾； 2—苯甲酸； 3—山梨酸； 4—糖精钠； 5—脱氢乙酸； 6—柠檬黄； 7—天门冬酰苯丙胺酸甲酯； 8—日落黄；9—对羟基苯甲酸乙酯； 10—对羟基苯甲酸丙酯图1 添加剂组分分离图A

由图1可见，有3种组分(脱氢乙酸、柠檬黄、天门冬酰苯丙胺酸甲酯)的出峰时间集中在10～12 min内，脱氢乙酸峰拖尾，三者未完全分离。另外，只有9种物质能找到对应的峰，对羟基苯甲酸丙酯在此条件下的柱内保留性较强，出峰时间在35 min以后，不利于高效检测。因此采用梯度淋洗，后期加强洗脱强度，缩短分析时间[8]。

针对实验过程中发现脱氢乙酸峰形有拖尾现象，分析其原因为脱氢乙酸本身极性较强，流动相在pH 7.0时极性相对偏弱，因此考虑降低流动相pH值，提高极性以改善脱氢乙酸的拖尾问题。经多次调整试验发现，将乙酸铵溶液酸度调至pH 6.0时脱氢乙酸拖尾即有明显改善。

采用0～10 min，甲醇-乙酸铵体积比为95∶5，10～30 min，甲醇-乙酸铵体积比为45∶55的梯度淋洗模式后，对羟基苯甲酸丙酯在26 min左右出峰，如图2所示。10种测定目标物均能在30 min内实现完全分离,但是由于柠檬黄在波长230 nm处的吸收较弱，响应偏低，因此在其出峰前将测定波长调整至254 nm,并将后期甲醇-乙酸铵流动相比例进一步调整为50∶50，得到如图3的分离图。

通过对流动相比例调整、梯度安排、pH值调节，并利用可变波长检测器的特征对检测过程中不同波长的选择试验，最终采用梯度淋洗模式：0～10 min内，甲醇-乙酸铵体积比5∶95；10～30 min内，甲醇-乙酸铵体积比50∶50。检测器用变波长扫描：0～13 min内，波长为230 nm；13～30 min内，波长为254 nm。仪器最佳条件:乙酸铵酸度为pH 6.0，柱温30℃，流速1 mL/min。

0—溶剂; 1—乙酰磺胺酸钾； 2—苯甲酸； 3—山梨酸； 4—糖精钠； 5—脱氢乙酸； 6—柠檬黄；7—天门冬酰苯丙胺酸甲酯； 8—日落黄；9—对羟基苯甲酸乙酯； 10—对羟基苯甲酸丙酯
图2 添加剂组分分离图B

0—溶剂; 1—乙酰磺胺酸钾； 2—苯甲酸； 3—山梨酸； 4—糖精钠； 5—脱氢乙酸； 6—柠檬黄； 7—天门冬酰苯丙胺酸甲酯； 8—日落黄；9—对羟基苯甲酸乙酯； 10—对羟基苯甲酸丙酯
图3 添加剂组分分离图C

2.3 工作曲线

对配制好的系列标准混合使用溶液进行测定，以浓度X(μg/mL)对相应的面积Y作外标曲线,回归方程及相关系数见表1。

表1 线性回归方程、相关系数

2.4 精密度试验

取同一空白样品平行试样3份,分别加入等量混合标准溶液，使样品提取液中各组分的浓度均为0.02 mg/mL,按1.2方法处理后测定其中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、糖精钠、乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)、天门冬酰苯丙胺酸甲酯(阿斯巴甜)、柠檬黄、日落黄的含量,结果见表2。由表2可见，测定结果的相对标准偏差为1.1%～3.3%，表明方法的精密度良好。

表2 精密度试验结果

2.5 回收试验

准确称取榨菜样品10.0 g置于125 mL锥形瓶中，按本实验方法处理及测定(n=3)，然后进行加标回收试验，结果见表3。由表3可见，回收率为96.6%～99.4%，表明方法的准确度较好。

3 结语

采用HPLC法同时测定榨菜中防腐剂、甜味剂、合成着色剂残留量，其重现性好、准确度较高，同时操作简便、快捷，能在30 min 内将10种添加剂基本分离，达到日常测定样品的要求。

表3 回收试验结果

[1] 张晓彤.液相色谱检测方法[M]. 北京：化学工业出版社，2000：6-44.

[2] 于世林.高效液相色谱方法及应用[M].北京：化学工业出版社，2005：288-296.

[3] GB/T 5009.35-2003 食品中合成着色剂的测定[S].

[4] GB/T 23377-2009 食品中脱氢乙酸的测定 高效液相色谱法[S].

[5] GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法[S]

[6] GB/T 22254-2008 食品中阿斯巴甜的测定[S].

[7] 张秀尧.反相高效液相色谱法同时快速测定食品中常见的8种食品添加剂[J].色谱，2000,18(6):539-542.

[8] 王亚平，周勇，黄鹂，等.高效液相色谱法同时测定酱腌菜中6种对羟基苯甲酸酯[J].浙江海洋学院学报(自然科学版)，2008,27(4):425-429.