超高效液相色谱法快速测定辣椒素类物质

2011-01-22 01:31赵春华侯倩慧余季金
化学分析计量 2011年5期
关键词:辣椒素色谱法标准溶液

赵春华 侯倩慧 余季金

(青岛华测检测技术有限公司,青岛 266101) (青岛普仁仪器有限公司,青岛 266046) (青岛大学,青岛 266071)

对辣椒或其提取物中辣椒素类物质的定量分析可采用铝蓝比色法、辣椒素分光光度法、高效液相色谱法、气-质联用法、液-质联用法等多种方法。经对比可知,传统方法成本低,但准确度不够理想。现代高档仪器分析法的灵敏度和准确度都较高,但仪器价格昂贵。目前普及的液相色谱因其性价比优越和方法可靠常被用于此项工作,但分析速度还有待进一步提高。

笔者采用的超高效液相色谱法有效地解决了上述问题,不但样品前处理较简单,而且实现了3种主要辣味成分在3 min内良好地分离,定性、定量准确。此法适用于辣椒及辣椒制品辣味水平的快速、准确测量评价。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪:ACQUITYTMUtra Performance LC型,配二元高压泵、二极管阵列检测器,美国Waters公司;

辣椒素(C):纯度为98%,于(20±4)℃条件下储存,国家标准物质中心;

二氢辣椒素(DHC):纯度为98%,于(20±4)℃条件下储存,国家标准物质研究中心;

甲醇:色谱纯,美国Teda公司;

酸性氧化铝:74~150 μm(100~200目),上海晶纯试剂有限公司;

其它试剂为分析纯。

1.2 标准溶液配制

准确称取辣椒素和二氢辣椒素标准品0.010 g(折算为纯品),用甲醇溶解准确定容至10 mL,配制成l g/L的标准贮备液,再用甲醇逐渐稀释分别得到0、1.0、10.0、30.0、50.0、70.0、100.0 mg/L的系列标准溶液。

1.3 样品前处理

将干辣椒样品用电动粉碎机粉碎,过0.391 mm筛。称取粉碎后样品1.0 g(精确到0.001 g)于50 mL离心管内,加入1.0 g酸性氧化铝粉,准确加入四氢呋喃-甲醇(体积比1∶1)溶液10 mL,涡旋,震荡1 min,再超声提取30 min。取出冷却至室温,移取100 μL用甲醇稀释10倍(可根据样品中辣素含量确定适当的稀释倍数),混匀,过0.22 μm滤膜备用。

1.4 色谱条件

色谱柱:BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm);柱温:40℃;流动相:A为水,B为乙腈,流速为0.3 mL/min;梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.5 定量测定

取系列标准溶液各进样3 μL,以浓度-峰面积绘制标准曲线(或取跟样品浓度相近的标准溶液进行单点校正),以保留时间和该点处的光谱图定性,峰面积定量。降二氢辣椒素(NDHC)与辣椒素共用同一条标准曲线。以斯科维尔指数(SHU)计,辣椒素同系物总量x按式(1)计算:

(1)

式中:V——定容体积,mL;

m——取样量,g;

ρNDHC——降二氢辣椒素质量浓度,mg/L;

ρC——辣椒素质量浓度,mg/L;

ρDHC——二氢辣椒素质量浓度,mg/L;

9 300、16 100——斯科维尔指数(SHU)换算系数。

图1、图2分别为0.01 mg/L的标准色谱图和样品色谱图。

图1 标准色谱图

图2 样品色谱图

2 结果与讨论

2.1 流动相及去甲二氢辣椒素色谱峰的确认

通过对常用洗脱溶剂甲醇、乙腈、水以及流动相pH值等条件的优化,确定了最佳洗脱条件,见1.4色谱条件。从C的主峰分出一明显的小峰(1.415 min),且该峰与C、DHC的峰面积比为1∶3∶6,基本符合辣椒中辣椒素同系物各组分含量的比例。该处的光谱图和1.587 min(C)及2.197 min(DHC)处的光谱图完全一样。由此可断定该峰为NDHC,理论上可以用辣椒素的标准曲线定量分析降二氢辣椒素。

2.2 检测波长的确定

从图2标准的光谱图可以看出C和DHC 的紫外全波长扫描图完全一致。在230 nm和280 nm 处出现两个吸收峰,230 nm 比280 nm 的吸收值高很多且峰形平缓,作为检测波长将更灵敏。但在短波长范围内有紫外吸收的物质越多,就越容易产生干扰。在280 nm处仪器的灵敏度已经满足测试要求,故采用280 nm处进行定量。

2.3 不同提取剂提取效果的比较

分别采用乙睛、饱和乙睛、四氢呋喃-甲醇(体积比1∶1)、甲醇、50%的甲醇水超声提取,试验发现,四氢呋喃-甲醇(体积比1∶1)的提取效果最好。

2.4 不同净化效果的比较

考虑使用石墨化碳和酸性氧化铝净化提取物里面的色素和油脂。净化后和净化前叠加色谱图如图3所示。

图3 叠加色谱图

从图3可以看出,使用酸性氧化铝粉使得样品前面很大的杂质峰得到很大程度的净化,而目标物C和DHC并没有明显损失。使用石墨化碳似乎已经除掉很多色素,但其前面的色谱杂质峰并没有很多变化,净化效果不理想。

2.5 检出限和定量限

对逐步稀释的标准溶液进行分析,以3倍信噪比(S/N)计算检出限,10倍信噪比为定量限。辣椒素、二氢辣椒素的检出限为0.05 mg/mL,定量限为0.25 mg/mL。

2.6 标准曲线方程

以6个浓度(1.0、10.0、30.0、50.0、70.0、100.0 mg/mL)水平绘制标准曲线,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标作校正曲线并进行线性回归。C的标准曲线回归方程为Y=7 690X+14 000,r=0.999 6;DHC的标准曲线回归方程为Y=7 010X+13 500,r=0.999 7。结果表明,C和DHC在1.0~100.0 mL/L浓度范围内线性良好。

2.7 回收试验

称取已知量的供试品1.0 g,共9份,每3份为一组,分别加入低、高浓度水平的标准贮备液。按1.3 进行样品前处理,分别进样并计算回收率,结果见表2。

表2 C和DHC回收试验结果

由表2可知,C和DHC的回收率分别为93.0%~100.0%、92.9%~97.4%。

2.8 精密度试验

取10.0 mg/L的标准溶液和样品制备溶液,按1.4色谱条件,分别连续进样5次,进行精密度试验。辣椒素、二氢辣椒素测定结果的相对标准偏差分别为0.8%、1.2%(n=5)。

3 结语

建立了用甲醇-四氢呋喃(体积比1∶1)混合溶液作提取溶剂,超声波法提取辣椒素,采用超高效液相色谱法测定辣椒素的方法。此方法具有简便快捷、准确度好、灵敏度高等特点。

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