柱前衍生化-高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成

孟海波 高绍丰 张海燕 孟汉卿

(济南圣泉唐和唐生物科技有限公司，济南 250204)

木糖、阿拉伯糖作为一种良好的食品添加剂已被广泛应用于食品生产中。它通常采用玉米芯等原料进行酸水解后，再经过结晶等工艺生产而成。木糖母液则是木糖结晶后留下的深色粘稠液体，里面含有木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等杂糖。木糖母液由于里面的杂糖含量高，导致其中木糖的溶解度大而无法采用传统的方法结晶出来[1]，所以木糖母液基本上是废液，只能低价卖给酱色厂做为原料生产焦糖色素[2]。然而目前已开发出通过生物发酵、色谱分离等技术从木糖母液中提取木糖、L-阿拉伯糖的生产工艺，这需要检测木糖结晶母液中各种单糖的含量。对木糖母液的检测不仅有助于木糖生产工艺的提高，也为木糖结晶液进行二次开发提供依据。

目前对木糖的分析有比色法[3]、纸层析法[4]和高效液相色谱法[5-7]，并且已有报道采用SCR-101N糖柱初步分析木糖结晶液的单糖组成[7]。然而这些方法只能检测糖液中的木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖这3种单糖的含量，对糖液中的其它糖类如半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、岩藻糖等均无法检测，影响到对木糖结晶母液发酵过程的进一步研究。为此，笔者采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化-高效液相色谱仪法[8]，用常规的紫外检测器和C18烷基键合柱，同时检测木糖结晶母液中的多种单糖，该法具有准确、快速、灵敏的特点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Ulti Mate 3000型，美国戴安公司；

乙腈：色谱纯，美国TEDIA公司；

PMP：化学纯，上海国药试剂有限公司；

葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、岩藻糖、纤维二糖：美国Sigma公司；

木糖结晶母液：焦作华康化工有限公司;

实验所用其它试剂均为分析纯。

1.2 溶液配制

(1)标准混合储备液

按照物质的量为0.8 mmol计算的单糖质量,精确称取8种单糖的标准品置于100 mL容量瓶中，用高纯水溶解并定容至刻度，配制成标准混合储备液，使用时稀释成所需浓度。

(2)样品试液

将木糖结晶母液离心，准确称取上清液0.5 g于100 mL容量瓶中，以高纯水稀释至刻度，混匀，供色谱分析用。

1.3 PMP柱前衍生物的制备

衍生化方法参考文献[8]，并进行适当的改进：取配制好的单糖标准混合液或者5 g/L木糖结晶母液样品各50 μL，置于不同的1.5 mL离心管中，依次加入50 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混匀，置于70℃恒温水浴中反应30 min，取出，冷却10 min，用50 μL 0.3 mol/L HCl中和，加入1 mL氯仿萃取，充分震荡，用细针头吸弃下层，重复3次。上层为水相，加入100 μL水稀释，混匀，然后用0.45 μm水性滤膜过滤，10 μL进样。

1.4 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，美国Waters公司；Dionex Ulti Mate 3000色谱系统；检测波长：250 nm；柱温：25℃；进样体积：10 μL；流动相：溶剂A为15%(体积分数)乙腈-0.05 mol/L磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)，溶剂B为40%(体积分数)乙腈-0.05 mol/L磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)，梯度模式列于表1，流速为1.0 mL/min。

表1 梯度模式

2 结果与讨论

2.1 单糖标准品PMP衍生物的HPLC分离

为实现木糖结晶母液中各组成单糖的高效分离，本实验对木糖母液可能包含的8种标准单糖PMP衍生物的高效液相色谱分离条件进行了优化。结果表明:磷酸缓冲液(K2HPO4-NaOH)的pH值为 6.9，时间梯度为0→10→20→30 min和相应浓度梯度为0→8%→15%→15%时溶剂B的梯度洗脱模式是分离此8种单糖衍生物的较理想色谱分离条件，单糖标准品的色谱分离图和木糖结晶母液的色谱分离图分别如图1所示。

(a)单糖标准品的色谱分离图

(b)木糖结晶母液的色谱分离图

2.2 标准曲线绘制

用高纯水将8种单糖标准混合储备液稀释为5个不同浓度的系列标准混合样，进样10 μL，分别测定峰高。以各标样峰高(Y)为纵坐标，浓度(X，μg/mL)为横坐标进行线性回归。各组分的线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限列于表2。

表2 8种单糖的线性回归方程、相关系数和检出限

2.3 精密度试验

取单糖标准混合储备液在1.4色谱条件下测定6次，测定色谱峰的峰高。根据线性回归方程计算单糖含量，测得甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖的相对标准偏差(RSD)分别为0.79%、0.84%、0.66%、0.86%、1.04%、1.21%、0.92%、0.81%，表明方法的精密度良好。

2.4 回收试验

将木糖结晶母液样品离心，准确称取上清液0.5 g 5份于100 mL容量瓶中，各加入1.2(1)制备的标准混合储备液适量，以高纯水稀释至刻度，混匀，进样分析。

根据分析结果计算回收率并列于表3。从表3可以看出，8个组分的平均回收率为98.4%～101.0%。

表3 8种单糖组分的回收率(n=5)

2.5 样品测定

取3个不同厂家样品按1.3方法操作，制备PMP衍生物溶液各3份，在1.4色谱条件下测定，外标法计算各单糖组分的含量，测定结果见表4。由表4可以看出，目前木糖厂结晶母液中主要单糖为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖，另外还有少量的纤维二糖、岩藻糖、鼠李糖和甘露糖。

表4 样品中单糖含量测定结果(n=3)

3 结论

通过PMP柱前衍生化-HPLC法，实现了利用紫外检测器和C18柱同时检测木糖结晶母液中的8种单糖，克服了以往使用糖分析柱只能检测到葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的缺陷，对进一步研究木糖结晶母液的发酵及分离过程提供了依据。该法分离效果好，分析速度快，测定结果准确可靠，适合检测木糖结晶母液的糖组分。

[1] 赵光辉,贺东海,王关斌.分离木糖(醇)母液的研究[J].应用化工, 2005,34(3):194-195.

[2] 李祥,杨军盛.木糖母液的综合利用[J].中国食品添加剂,2002(5):54-56.

[3] 王文岭，黄雪松.DNS法测定木糖含量时最佳测定波长的选择[J].食品科学,2006,27(4):196-197.

[4] 赵玉英,邱晓云,色音巴图.玉米秸中糖含量的纸层析研究[J].内蒙古民族师范学院学报：自然科学版,1999(2):151-153.

[5] 蔡婀娜,李夏兰,方柏山.HPLC法检测发酵液中的木糖和木糖醇[J].漳州师范学院学报:自然科学版,2006(2):56-59.

[6] 方宏,曾健智,陈海珊，等.高效液相色谱法检测蔗渣半纤维素水解物中的单糖[J].广西科学院学报,2006,16(3):124-126.

[7] 孙广仁,宋媛,梁天王.HPLC法分析木糖结晶母液中的糖组分[J].安徽农业科学,2008,36:284-285.

[8] 杨兴斌,赵燕,周四元，等.柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成[J].分析化学,2005,33(9):1 287-1 290.