三七内生真菌分离与分子鉴定(I)

张玉洁，和泽高，唐龙山，常 征，陈中坚，张 铁

(1.文山学院生化系，云南文山663000;2.文山州生物资源开发研究中心，云南文山663000;3.文山苗乡三七实业有限公司技术中心，云南文山663000)

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科人参属多年生草本植物，是名贵中药材，是我国特有植物种类。由于对环境要求的特殊性，三七主要集中分布于云南和广西。其中，云南是目前公认的三七道地药材的主产区，占三七年产量的95%［1－2］。植物内生真菌是生长于植物根、茎、叶等组织的细胞间隙或细胞内的一类真菌，是植物微生态系统中的重要组成成分。迄今所研究的植物体内均发现存在内生真菌，少则十几种，多则几百种［3］。植物内生菌长期生活在寄主植物体内，并与植物协同进化，在演化过程中形成了密切的互惠共生关系［4］。内生菌对植物生长发育和系统演化发挥重要作用，如促进寄主植物对营养物质的利用［5］、产生激素促进植物生长［6］、提高寄主适应逆境包括抗旱、抗寒、抗盐碱、耐高温等的能力［7］、协助植物抵抗病虫害［8］、增强植物抗重金属的能力［9］等。此外，“内共生理论”认为生物次生代谢过程中生化途径的连续演化会导致有益物质进入到共生体中。因此，宿主体内的个别内生菌产生与宿主相同或相似的生理活性成分是由于两者的长期共生关系导致宿主可能将其遗传物质或信息传递给其内生真菌，使之具有与宿主相同或相似的代谢途径并产生具有相同或类似结构的活性产物［10］。为了研究三七内生菌的生理生态功能，本文首先对三七内生真菌进行了初步分离和鉴定。

1 材料

三七采自文山县苗乡三七实业有限公司砚山基地，分别采集一年生、两年生、三年生健康三七共48棵。

2 方法

2.1 内生菌分离纯化

内生真菌分离培养基为PDA－抗生素培养基，纯化及测试菌培养基为PDA培养基。分离方法参考Silvani，et al.，(2008)［11］: 取新鲜健康三七的根、茎、叶，流水冲洗干净后进行表面消毒处理;处理完毕，在无菌条件下，用灭过菌的手术刀切去表层组织，将中间部分切成约0.5 cm大小接种于PDA培养基上，置25°C培养;观察材料边缘有菌落长出，将不同的菌落分别挑至PDA培养基中;将菌种在培养基中培养，逐步进行分离纯化，直至得到纯化的单菌株。将得到的菌株转接到PDA斜面培养基保存。

2.2 内生真菌的分子鉴定

将菌种接种到PDA液体培养基中培养5～10 d，视菌丝生长速度不同而定。无菌过滤菌丝并取少量置于无菌研钵内，加入适量CTAB(Cetyl Triethyl Ammonium Bromide)彻底研磨，利用CTAB法从新鲜菌丝中提取待测菌株的DNA。以所提DNA为模板利用引物 ITS5(5’－3’:GGAAGTAAAAGTCGTCACAAGG 正向)和 ITS 4(5’－3’:TCCTCCGCT-TATCGATATGC反向，White et al.1990)扩增真菌基因组ITS序列，引物由上海生物工程技术有限公司合成(PAGE纯化)。PCR采用 50 μL体系，反应条件:95℃预变性5 min，然后以95℃，1 min、55℃，30 s、72℃，1 min进行25个循环，72℃延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送上海生物工程公司测序。利用BLAST程序对所测内生真菌ITS序列进行在线同源性比对。

3 结果及分析

3.1 三七内生菌的分离

从健康三七根、茎、叶中分离并经初步形态归类得158株不同的内生真菌。

3.2 三七内生真菌的种属

表1 三七内生真菌种类

对其中92株三七内生菌进行了DNA提取和PCR扩增。根据ITS序列与GenBank中的序列同源性关系，将所得菌种归类为表1所示19+1个属。从表中种属归类可见三七内生真菌种类多样性丰富，同时，在植物体内微环境中，不同的微生物能相互作用，形成一种相对稳定的微生物菌群。其中一些是分离频率高、数量大的优势种，如镰孢霉属、球壳菌属和炭角属等;而另一些属于稀有种，如座坚壳属(Rosellinia sp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.)、Setophoma sacchari(无中文名)等属只有1株。三七根茎叶不同部位都分离到多株内生菌，说明内生菌普遍存在于三七各器官中，但内生菌在各器官中的分布差异较大，寄居于茎、叶中的内生菌种类和数量相对较多，而块根中的内生菌种类和数量相对较少。

4 讨论

三七内生真菌优势种中只有孢镰孢菌属是常见的病原菌，但仍有报道某些孢镰孢属真菌属于内生菌，并可产生抗菌、抗肿瘤活性物质。其它优势菌如毛壳菌属(Chaetomium sp.)、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)、光黑壳属(Preussia sp.)真菌均有报道可作为多种植物病害的生防菌株［12］。其中，毛壳菌属Chaetomium sp.真菌在自然界广泛分布，是一类应用前景广阔的植物病害生物防治菌，不仅能有效地防治多种蔬菜、林木和其它大田作物的病害，还能够降解木质素等难降解物质［13］。多节孢属的多种真菌如树状多节孢、明孢多节孢等有报道可以产生紫杉醇，指状节丛孢菌可以捕食线虫［14］。植物内生和土壤中粉红粘帚霉属具有抵抗多种土传病害的作用［15］。2008年研究人员对生长在南美洲热带雨林中的Ulmo树中分离到一种粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)，并发现此真菌能够直接利用纤维素产生混合烃柴油混合物，是绿色能源的一个全新的发现，目前正在研究它的生物燃料生产潜力。本研究除从三七中分离得到了与以上内生真菌相似性极高的菌种外，还得到一株与GenBank中已报道的基因序列的相似性仅为82%菌株，认为是一新种。以上研究结果表明，三七内生菌中可培养真菌较为丰富，是潜在的新的微生物菌种资源，具有进一步研究的价值。

［1］ 林景超，张永煜，崔健.我国三七产业的发展现状及前景［J］．药业纵横，2005，(2):18.

［2］ 余育凤，任祖云.三七产业可持续发展的对策研究［J］．文山学院学报，2011，(1):110－114.

［3］ Hyde KD.Diversity of ascomycetes on palms in the tropics［M］．In:Biodiversity of Tropical Microfungi.(K.D.Hyde，eds.)．Hong Kong:Hong Kong University Press，1997:141－146.

［4］ Rodriguez RJ.Fungal endophytes:diversity and functional roles.New Phytologist，2009，182:314 －330.

［5］ Mandyam K and Jumpponen A.Seeking the elusive function of the root－colonising dark septate endophytic fungi［J］．Studies in Mycology，2005，53:173 －189.

［6］ Tudzynski B，Sharon A.Biosynthesis，biological role and application of fungal phyto－hormones［M］．In:Osiewacz HD，ed.The mycota X.Industrial applications.Berlin，Ger-many:Springer－Verlag，2002:183 －212.

［7］ Jose G.Assessing fungal root colonization for plant improvement［J］．Plant Signaling ＆ Behavior，2009，45:445－447.

［8］ Rodriguez RJl.Stress tolerance in plants via habitat－adapted symbiosis［J］．International Society of Microbial Ecology，2008，2:404 －416.

［9］ Jiang M.The Relationship of Heavy Metal Resistant Endophyte and the Heavy Metal Resistance Ability of Their Host Plants［J］．Journal of Agro － Environment Science，2007，(6):2038－2042.

［10］ Yu H.Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes［J］．Microbiol Res，2010，27:467 － 471.

［11］ Silvani，V.A.，Fracchia，S.，Fernández，L.，Pérgola，M.，Godeas，A.A simple method to obtain endophytic microorganisms from field－collected roots［J］．Soil Biology＆Biochemistry，2008，(5):1259 －1263.

［12］ Campanile.Antagonistic activity of endophytic fungi towards Diplodia corticola assessed by in vitro and in planta tests［J］．European Journal of Plant Pathology，2007，117:237－246.

［13］ 程敬丽，阮璐璐，陆一夫，等.内生真菌代谢产物球毛壳菌素 A的液相色谱分析［J］．农药，2011，(1):43－45.

［14］ 赵凯，平文祥，周东坡.内生真菌发酵生产紫杉醇的研究现状与展望［J］．微生物学报，2008，(3):403－407.

［15］ 陶萌，李世东，张拥华.土壤中生防菌粉红粘帚霉67－1的荧光定量 PCR检测方法［J］．中国生物防治，2009，(1):35 －40.