固本补肾汤对前列腺基质细胞增殖的影响

朱 闽，覃兆伟，荀建宁，梁永协，周 凯

广西中医学院附属瑞康医院男性科，广西南宁 530011

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）多见于老年人，发病率随着年龄的增加而呈上升趋势[1]。迄今为止BPH的发病机制尚未完全明了，但总是细胞增殖和细胞凋亡共同作用的结果。笔者为探讨固本补肾汤治疗BPH的作用机制，进行了体外人前列腺基质细胞的培养，用四氮唑蓝法（MTT）检测药物对体外培养人前列腺基质细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本来源 本次研究细胞培养用的前列腺组织块取自经耻骨上前列腺摘除术切除的前列腺标本，每分标本重量2～3 g，经组织学证实为BPH组织。

1.1.2 主要实验试剂 1640培养液（美国Glbco公司），DMEM培养液（美国Glbco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），马血清（美国 Gibco公司），MTT（美国 Sigma公司），二甲基亚砜（美国Sigma公司），逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒TakaPa RNA PCR Kit(Amv)Ver3.0（武汉博士德生物有限公司），Trizol核酸提取液（美国sigma公司）。

1.1.3 主要实验仪器 CO2恒温培养箱（TC2323型，美国Sheloln），超净工作台（苏州真田洁净设备有限公司），相差倒置显微镜（ECLIPSETE300型，日本Nikon公司），96孔培养板，25 cm2培养瓶（日本Nuco公司产品），PCR基因扩增仪（TC-48/T/H（a）杭州大和株式会社），电泳仪（杭州大和株式会社），DU640核酸/蛋白分析仪（美国 BECKMAN COULTER）。

1.2 实验药物

固本补肾汤方药：黄芪15 g、党参10 g、枸杞子12 g、丹参15 g、当归12 g、肉苁蓉10 g、王不留行15 g等。按剂量以农本方（香港培力南宁药业有限公司提供，每一味中药浓缩剂均已独立取得国家正式生产批文）溶于Hank's中，用细胞培养液稀释至1 g/ml，1 500 r/min，离心5 min去除沉淀，用0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。枸橼酸他莫昔芬片：由上海华联制药有限公司生产（国药准字H10910072），10 mg/片，用Hank's液溶解，用细胞培养液稀释配制成1 ng/ml，制备方法同前。

1.2 方法

1.2.1 前列腺基质细胞原代、传代培养及纯化、鉴定 在超净台上将前列腺组织剪为约1 mm3大小，采用组织块贴块法进行接种，参照文献[2-3]进行原代及传代培养（基质细胞培养液中加入雌二醇作为促增生剂），采用自然纯化法、机械化除法、差速贴壁法纯化基质细胞。培养3～4代后基本上可得到纯化的基质细胞，采用RT-PCR法检测平滑肌分化特异性蛋白smoothelin的表达（smoothelin片段：上游引物5-GGTCGAAGATGCTGCCCATCTT-3′、下游引物 5′-TCCGACAAAGGAAGAGAGACC-3′、片段长度为 324 bp；同时以 β2微球蛋白引物扩增片段作为内参标：上游引物5′-AGAGCTACCTGTGGAGCAACCT-3′、下游引物 5′-ATGCCTGCCGTGTGAACCATGT-3′、片段长度为285 bp），检测结果基质细胞纯度达98%。

1.2.2 实验药物细胞毒性实验 将制备的固本补肾汤溶液用DMEM培养液以几何比稀释，对基质细胞培养24 h后，观察细胞情况，并根据光密度（optic density，OD）值计算药物对细胞的毒性作用[公式为：（药物组平均OD-空白组平均OD）/空白组平均OD×100%]，取毒性作用＜15%的浓度作为观察浓度。按细胞毒性实验结果，设实验药物高（10 ng/ml）、中（1 ng/ml）、低剂量组（0.1 ng/ml），他莫昔芬组，并设模型对照组及空白对照组，进行干预培养，每组重复5瓶。

1.2.3 MTT法检测固本补肾汤对前列腺基质细胞的增殖作用影响 取第4代细胞悬液以4×104/ml浓度接种于96孔板，每孔500 μl，培养24 h使细胞贴壁，用Hank's液冲洗2次。换成含0.5%进口马血清的DMEM培养液24 h后，同时每孔加入含药细胞培养液，每孔加500 μl，每浓度4个复孔，设他莫昔芬对照组5个，并设模型对照组5个，不含药物，而加入等量的培养液（含雌二醇），另设空白对照组5个（培养液中不含雌二醇），在37℃，5%CO2恒温箱中放置24 h，在每孔中加5 mg/ml MTT 20 μl，同样条件下培养 4 h，终止培养，吸取孔内培养液，每孔加入100 μl的二甲基亚砜，室温下震荡5 min，使结晶物充分溶解，在590 nm处测OD值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验。

2 结果

在24 h时，他莫昔芬组及固本补肾汤各剂量组对细胞生长有都明显的抑制作用，与模型组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；固本补肾汤各剂量组之间比较，差异有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05）；低剂量组与他莫昔芬组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量组与他莫昔芬组比较，差异有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05）。 见表1。

表1 固本补肾汤对基质细胞增殖的影响（OD 590 nm，±s）

表1 固本补肾汤对基质细胞增殖的影响（OD 590 nm，±s）

注：方差分析：F（OD）值=46.480，P＜0.01；与空白组比较，*P＞0.05，△P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.01；与他莫昔芬组比较，#P＞0.05，○P＜0.05，●P＜0.01；与低剂量组比较，☆P＜0.01，★P＜0.05；与中剂量组比较，◇P＜0.05

组别 例数 OD值空白组模型组他莫昔芬组低剂量组中剂量组高剂量组555555 0.189±0.004 0.273±0.023△0.190±0.005*▲0.198±0.004*▲#◇0.211±0.008△▲○★0.226±0.004△▲●☆

3 讨论

BPH是由于前列腺上皮或基质细胞增生，引起的一系列下尿路梗阻症状，但BPH患者的临床症状并不与增生的前列腺腺体大小成正比[4]组织学的研究提示了前列腺基质成分在BPH发病中的重要性[5]。历代医家多将其归属于中医“癃闭”的范畴。现行的中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》正式将其定名为“精癃”，病位在膀胱与精室。

《景岳全书·积聚》云：“凡脾肾不足及气弱失调之人，多有积聚之病。”本病多由于年老体弱，或因年老阴阳气衰而致脾虚，气化无力，日久痰浊瘀血留滞而成，属本虚标实。刘猷枋教授也提出肾气虚、气化不利和瘀血内阻是BPH发生的最重要因素[6]。固本补肾汤方中黄芪、党参益气利水，大补脾气而达到气化得行，则小便自通的目的；丹参、当归活血化瘀，破宿血、补新血；王不留行活血通络、利尿通淋；枸杞子、肉苁蓉以补肾化气。全方以益气活血为主，辅以补肾之品，以达到补肾化气、活血散结的作用。

本次研究通过MTT法检测了固本补肾汤对体外培养人前列腺基质细胞增殖的影响，结果表明固本补肾汤能抑制体外培养前列腺基质细胞的增殖，这可能是固本补肾汤治疗良性前列腺增生症的作用机制。

[1]刘本臣.中医药治疗良性前列腺增生症的研究进展[J].甘肃中医,2007,20(12)：68-70.

[2]鄂征.组织培养和分子细胞学技术[M].北京：北京出版社,2001：35-38.

[3]司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安：兴界图书出版,2003：22-77.

[4]蔡蔚,朱闽,周青,等.前癃通胶囊治疗良性前列腺增生症36例临床观察[J].中医药导报,2008,14(6)：74-76.

[5]陈辉熔,邓春华,丘少鹏,等.前列腺增生病人前列腺基质成分含量的变化[J].中华男科杂志,2001,7(6)：362-364.

[6]张亚强,卢建新,宋竖旗.中医药治疗前列腺疾病的研究现状[J].中国中西医结合外科杂志,2010,16(3)：255-258.