利用血红素制备原卟啉钠的工艺优化研究

赵金红,许金鹏,李朝品

(1.皖南医学院 人体寄生虫学教研室,安徽 芜湖 241002;2.安徽中医学院第一附属医院 检验科,安徽 合肥230031)

原卟啉钠(Protoporphyrin disodium,NAPP)是一种卟吩衍生物,化学名称为1,3,5,8-四甲基-2,4-二乙烯基卟吩-6,7-二丙酸钠,由4个吡咯环经4个次甲基键连接而成的含共轭双键的大环化合物,可促进组织细胞呼吸,改善蛋白质和糖代谢,具有保肝降酶作用,临床用于治疗急、慢性肝炎,并对肝硬化、胆囊炎及胆石症有一定疗效[1,2]。目前制备原卟啉钠的工艺普遍存在操作繁杂、中间产物多、周期长、制备成本高等缺点[3～5]。为克服上述不足,本研究以血红素为原料,建立并优化了原卟啉钠制备工艺,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 血红素(本实验室自制,纯度为90.8%),丙酮、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、甲醇、氯仿、甲苯、硫酸亚铁等(国产分析纯),溴化钾(国产光谱纯),原卟啉钠标准品(Sigma公司,纯度≥98.0%);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,RE-2000),循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司,SHB-Ⅲ),超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司,JY96-Ⅱ),紫外分光光度计(苏州岛津,UV-2550)。

1.2 原卟啉钠的制备工艺 血红素5.0 g加入甲醇与氯仿的混合液中(甲醇:70 ml,氯仿:120 ml),再加硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)4.5 g,搅拌20 min,通氯化氢气体60 min(脱铁)。反应液移入三角烧瓶内,90℃加热回流2 h(酯化),冷却后,抽滤,用100 ml氯仿冲洗沉淀,收集滤液,加入等体积双蒸水,用力振荡,洗涤滤液,转入分液漏斗内,静置分层,分取氯仿层(生成的原卟啉二甲酯溶于其中,呈紫红色),继续加适量双蒸水洗涤氯仿层至中性,旋转蒸发仪蒸去氯仿层中的氯仿,原卟啉二甲酯析出,向回收氯仿后的残留物中加入50 ml甲苯,加热,待析出的沉淀溶解后,再加入1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液80 ml,90℃加热回流2 h(皂化),冷却后原卟啉钠生成析出,抽滤,用适量氯仿洗涤2次后干燥,即得原卟啉钠,称重,并计算原卟啉钠产率。

1.3 原卟啉钠样品的定性测定 紫外-可见吸收光谱法:将原卟啉钠标准品与提取的原卟啉钠样品105℃干燥至恒重,准确称量干燥好的原卟啉钠标准品和样品,用1%盐酸甲醇溶液溶解,制成200 mg/L的标准品和样品溶液的母液备用。再分别制成2.00 mg/L的稀溶液,用紫外分光光度计于300～700 nm波长范围内扫描。

1.4 原卟啉钠样品的含量和纯度测定

1.4.1 原卟啉钠标准曲线的绘制 以1%盐酸甲醇溶液为空白,用紫外分光光度计于最大吸收波长409 nm处测定不同浓度的原卟啉钠标准品溶液的吸光度。以原卟啉钠标准品溶液的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。

1.4.2 原卟啉钠的精密度和回收率

1.4.2.1 精密度:量取原卟啉钠标准品母液,制成2.00 mg/L的标准品溶液,在409 nm处测定其吸光度,计算相对标准偏差(RSD)结果。

1.4.2.2 回收率:量取9份原卟啉钠样品母液0.50 ml,分为3组。每组分别加入原卟啉钠标准品母液0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml,用1%盐酸甲醇溶液定容至100 ml,测定结果作为加样回收试验的测得回收量。此外,另分别移取原卟啉钠样品母液0.50 ml和原卟啉钠标准品母液0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml,用1%盐酸甲醇溶液定容至100 ml,测定结果作为样品加入量和标准品加入量。在409 nm处分别测溶液的吸光度,代入回归方程计算加样回收率。

1.4.3 原卟啉钠样品的含量和纯度测定 制浓度为2.00 mg/L的原卟啉钠样品溶液,以1%盐酸甲醇溶液为空白,在409 nm波长处测得吸光度,代入回归方程,计算出2.00 mg/L的原卟啉钠样品溶液中原卟啉钠含量,并利用纯度计算公式计算提取的原卟啉钠样品的纯度。

1.5 单因素试验对原卟啉钠制备工艺的优化 根据预实验结果和影响酯化、皂化反应的因素、条件等,本研究选择酯化时甲醇用量、皂化时的1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量、加热回流温度、加热回流时间4个主要因素,采用单因素方法,以血红素为原料,对NAPP的制备工艺进行优化。

每次以5.0 g血红素为原料,按上述制备工艺制备原卟啉钠,比较酯化时不同甲醇用量(50 ml、60 ml、70 ml、80 ml)、皂化时不同1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量(60 ml、70 ml、80 ml、90 ml)、不同加热回流温度(70℃、80℃、90℃、100℃)、不同加热回流时间(1 h、1.5 h、2 h、2.5 h)对原卟啉钠产率的影响,以确定最佳的制备条件和参数。

2 结果

2.1 原卟啉钠样品的一般性质和产量 制备的原卟啉钠为紫褐色结晶,易溶于水和酸性甲醇溶液,微溶于稀盐酸溶液,不溶于氯仿,105℃不熔解。该法制备原卟啉钠的平均产量为3.46 g/5 g血红素,平均产率为69.2%。

2.2 原卟啉钠样品的定性结果 紫外-可见吸收光谱法结果显示,于300～700 nm波长范围内,原卟啉钠样品与标准品的光谱图基本一致,分别在409 nm、556 nm、600 nm波长处显示吸收峰,最大吸收峰在409 nm处(图1)。

图1 原卟啉钠样品与原卟啉钠标准品的紫外-可见吸收光谱图1.原卟啉钠标准品;2.原卟啉钠样品Fig 1 Ultraviolet-visible absorption spectrum of NAPP sample and standard substance1.NAPP standard substance;2.NAPP sample

2.3 原卟啉钠样品的含量和纯度 原卟啉钠标准曲线的回归方程为у=0.3801x+0.0029(R2=0.9997),相关系数趋近于1,该回归方程可用于计算原卟啉钠样品中原卟啉钠的含量。平均吸光度值为0.7545,RSD=0.32%(n=6),平均回收率为99.49%,RSD=1.99%(n=9),表明该法测定原卟啉钠的精密度、回收率良好。

经计算,原卟啉钠样品溶液中原卟啉钠含量为1.74 mg/L,纯度为88.8%。

2.4 原卟啉钠制备工艺优化的结果

2.4.1 最佳甲醇用量 实验结果显示,甲醇用量为50 ml时,原卟啉钠产率仅23.5%,随着甲醇用量的增加,原卟啉钠产率增高,当甲醇用量达到70 ml时,原卟啉钠产率达68.7%,但当用量为80 ml时,产率几乎不再增高(图2),结合成本等因素,故确定最佳甲醇用量为70 ml。

2.4.2 最佳1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量 实验结果显示,1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量为60 ml时,原卟啉钠产率为45.3%,随着加入量的增加,原卟啉钠产率相应增高,当1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量达到80 ml时,原卟啉钠产率达67.5%,但当加入90 ml时,产率为68.2%,增高不明显(图3),鉴于成本考虑,确定最佳的1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量为80 ml。

图3 不同1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量对原卟啉钠产率的影响Fig 3 Effect of different concentration of 1 mol/L sodium hydroxide-methanol solution on yield of NAPP

2.4.3 最佳加热回流温度 实验结果显示,加热回流温度为70℃时,原卟啉钠产率仅为31.5%,随着温度的升高,原卟啉钠产率随之增高,加热回流温度为90℃时原卟啉钠产率增至69.1%,但当加热回流温度升至100℃时,原卟啉钠产率反而下降至60.8%(图4),故确定最佳加热回流温度为90℃。

2.4.4 最佳加热回流时间 实验结果显示,加热回流1 h时原卟啉钠产率仅43.8%,随着加热回流时间延长,原卟啉钠产率迅速增高,当加热回流2 h时其产率迅速增加至65.5%,但加热回流时间延长至2.5 h时原卟啉钠产率仅增加1.6%(图5),鉴于成本和生产周期等因素考虑,因而确定最佳加热回流时间为2 h。

图4 不同加热回流温度对原卟啉钠产率的影响Fig 4 Impact of different heating and distilling temperature on yield of NAPP

图5 不同加热回流时间对原卟啉钠产率的影响Fig 5 Impact of different heating and distilling time on yield of NAPP

3 讨论

原卟啉钠在体内外具有一定的抗炎和抗变态反应作用,亦有报道NAPP对肝癌、胃癌、食道癌、肺癌等有抑制癌性疼痛、预防转移、增加食欲的作用[6,7]。目前报道的以血红素为原料制备原卟啉钠的方法大多需经过粗原卟啉、原卟啉二甲酯、原卟啉纯品等中间制备过程才能制得原卟啉钠。存在的缺点是中间产物多、操作繁杂、生产周期长、需要柱层析分离纯化及制备成本高等[3～5]。本研究中原卟啉钠的制备是以本实验室自制的血红素为原料,经硫酸亚铁-氯化氢气体-甲醇-氯仿脱铁酯化成原卟啉二甲酯,原卟啉二甲酯无需分离,直接经氢氧化钠甲醇溶液皂化制得原卟啉钠。这样既减少了中间产物,简化了操作步骤,又革除了柱层析,制备周期大大缩短,所用氯仿又可经蒸馏回收而重复利用,既降低了制备成本,又减少了其对环境的污染。

本研究根据酯化与皂化反应的条件和特点及预试验的结果选择了酯化时的甲醇用量、皂化时的1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量、加热回流温度、加热回流时间4个因素,分别研究了其对原卟啉产率的影响。结果显示,甲醇用量达70 ml时,酯化反应速率已达到最高,即使增加甲醇用量也不能促进酯化反应进行;随着氢氧化钠甲醇溶液量的增加,促进皂化反应的进行,原卟啉钠产率随之增高,当用量达80 ml时,反应速率已达到最高,即使再增加氢氧化钠甲醇溶液量也不能促进皂化反应进行;温度升高可以促进酯化和皂化反应进行而使原卟啉钠生成增加,但酯化和皂化反应是可逆反应,当加热回流温度升至100℃时,原卟啉钠产率反而下降至60.8%,可能由于酯化和皂化反应的逆反应速率更快而使原卟啉钠生成减少,产率下降。故确定最佳甲醇用量为70 ml,最佳1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液用量为80 ml,最佳加热回流温度为90℃,最佳加热回流时间为2 h。

本研究建立了原卟啉钠的制备工艺,并确定了最佳制备条件,这为原卟啉钠的生物活性研究奠定了基础。

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