两种具长效性重组人血清白蛋白/干扰素α融合蛋白表达工程菌的构建及融合蛋白的理化特性研究

富岩，韩国，杨小楠，富俞淞，邢静，胡俊霞，陈颖，云文琦，于在林

两种具长效性重组人血清白蛋白/干扰素α融合蛋白表达工程菌的构建及融合蛋白的理化特性研究

富岩，韩国，杨小楠，富俞淞，邢静，胡俊霞，陈颖，云文琦，于在林

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2011, 6(2):84-95

目的对两种长效干扰素 α 融合蛋白原料药的理化特性多项指标开展分析和进行比较。

方法利用基因工程技术分别构建了可高效表达重组人血清白蛋白/干扰素 α2a 融合蛋白（rHSA/IFNα2a）或重组人血清白蛋白/干扰素 α2b 融合蛋白（rHSA/IFNα2b）的毕赤酵母工程菌。融合蛋白直接分泌到组分简单的无机盐培养基中，并经特别建立的高效分离纯化工艺进行纯化，随后对两个融合蛋白进行详尽的理化特性分析。

结果获得的融合蛋白纯度在 98% 以上；N 端前 15 个氨基酸序列与理论序列相同；质谱分子量分别为 85640.8 D和85781.5 D；圆二色光谱分析比对蛋白空间构象未变；等电点 pI 约在 5.1 左右；为非糖基化蛋白；紫外光谱呈典型蛋白质光谱；自由巯基含量测定值为 1.4；肽图批次间一致；肽质量指纹图谱可匹配分别达 83% 和 82%；对制备的2 个融合蛋白原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性 DNA、甲醇和甘油的残留量检测符合标准要求；融合蛋白的免疫学鉴别为阳性；体外细胞生物比活性约为 2.5 ×105IU/mg，并且 2 个融合蛋白生物比活性测定值无不同，由此，获得了符合临床用药标准的原料药。

结论研究所获得的结果可以作为指导《注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α2a 融合蛋白》和《注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α2b 融合蛋白》2 个新药的原料药生产质量标准的建立和检定方法的确定。

干扰素 α； 血清白蛋白； 毕赤酵母； 重组融合蛋白质类

人干扰素（human interferon，hIFN）是一类重要的细胞因子，它是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过对侵染源做出应答反应而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。干扰素 α 属于I 类干扰素，主要有干扰素 α2a 和干扰素 α2b，均由白细胞产生，并且干扰素 α2a 和干扰素 α2b 是现在临床上使用最为广泛的慢性病毒性肝炎的特效药[1]。两者的氨基酸序列仅在第 23 位的氨基酸不同，干扰素 α2a 是精氨酸（K），而干扰素 α2b 是赖氨酸（R）。市售重组干扰素 α 是由细菌或毕赤酵母菌表达的非糖基化蛋白质药物，可用于乙型肝炎、丙型肝炎和部分癌症的治疗[2]。对临床应用结果观察表明，不同个体对这两种干扰素 α 的反应不同，使得它们一定要作为两个完全独立的治疗用药物来适用于不同个体的临床治疗应用中。由于重组干扰素 α 的血药半衰期仅有 3 h，患者需要每天1 次或隔天的频繁连续用药达 6 个月以上才具有治疗效果，患者的依从度极低，难以获得良好的治疗效果[3]。为此，研发具长效性重组干扰素 α2a 和α2b 是十分必要的。利用聚乙二醇（PEG）化学修饰法对重组干扰素 α 进行加工，可以使得重组干扰素 α 长效化[4]。但是，所有 PEG-干扰素 α 都是在常规的原液基础上进行再次加工，修饰得率不高，临床用药剂量大大提高、生产成本也远高于常规药物 20 倍以上，同时产生的副作用也较为明显[5]。为此，寻找新的干扰素长效化的方法一直在继续。

人血清白蛋白（HSA）是一种可溶性的、含有585 个氨基酸和 17 对二硫键的一种球状非糖基化蛋白质。人体内每升血液含有约 50 g 血清白蛋白，从而构成人体血液中蛋白总量的一半以上，并作为血液中的最主要和最基本的载体，携带和传递多肽蛋白质分子、脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素，同时白蛋白在血液中的半衰期为 14 ～ 20 d[6]。白蛋白抵御生物体内酶解的作用具有极大的优势，当其在与治疗性蛋白质形成融合蛋白后，使得治疗性蛋白质的半衰期获得延长。1992年，Yeh 等[7]首次提出了利用酵母分泌的白蛋白/CD4 融合蛋白用于人类疾病的治疗设想。十年来本课题组已对多种血细胞刺激因子融合蛋白、多种干扰素、白介素、皮肤细胞生长因子进行了作为长效药物的可能性研究，并获得大量研究资料和结果[8-10]。另外，Osborn 等[11]对人血清白蛋白与干扰素 α2b 融合蛋白（Albuferon）在猴体内进行的药代/药动（PK/PD）试验研究，Halpern 等[12]对人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白：Albugranin 的动物试验结果都显示出不同的人血清白蛋白融合蛋白在动物体内均具有比常规重组蛋白质药物更长的体内半衰期特性。对人血清白蛋白与治疗性蛋白质形成的融合蛋白所进行的研究，展示了一个新的蛋白质药物长效化的技术方法。融合蛋白 Albuferon 和 Albugranin 均是由酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）表达和制备，而本课题组的白蛋白融合蛋白均是由毕赤酵母菌（Pichia pastoris）表达制备的。除了重组人血清白蛋白/干扰素 α2b 融合蛋白有较详细的报道外[11,13-14]，重组人血清白蛋白/干扰素 α2a 融合蛋白和其他白蛋白融合蛋白的理化特性均未见报道。

利用我们创建的人血清白蛋白与治疗性蛋白质的“无缝连接”方式将人血清白蛋白基因和治疗性蛋白质基因融合，重组在酵母菌或脊椎动物细胞染色体上，将完整的融合蛋白分泌到细胞外。融合蛋白可以经我们建立的一个具通用性的简捷分离纯化工艺[15]，获得符合临床用药要求标准的高纯度原料药（原液）。为了获得质量稳定，安全有效的可用于临床用药的注射用针剂，进行了融合蛋白通用型制剂配方的筛选，可将人血清白蛋白融合蛋白制成为稳定可靠的冻干粉针剂[16]。数个具长效性的重组人血清白蛋白/治疗性蛋白质融合蛋白候选新药已经由本课题组通过这一技术平台完成了包括药学研究、动物安全性评价和临床试验方案设计在内的临床前研究工作，进入申报临床试验研究许可阶段。

本文首次报道了由毕赤酵母（Pichia pastoris）重组工程菌分泌表达，经过分离纯化工艺获得的两种干扰素 α 融合蛋白所开展的理化特性分析，获得的研究数据对理解人血清白蛋白融合蛋白的蛋白质特性、对融合蛋白可在体内形成长效性，提供了分子结构的基础性证明，也将对同类融合蛋白研究提供启示作用。这些研究结果也将作为《注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α2a 融合蛋白》和《注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α2b 融合蛋白》新药的质量标准和检定指标（制检规程），用于指导今后临床用药的生产质量控制，具有实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 本研究中使用的化学试剂均为分析纯或药用级；限制性内切酶、DNA 连接酶、聚合酶、胰蛋白酶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、DNA和蛋白质分子量标准品均购自美国 Promega 公司；分离纯化介质填料均购自美国 GE Healthcare公司；两性电解质购自美国 Ampholyte 公司；等电点标准品购自美国 Bio-Rad 公司；人血清白蛋白特异单克隆抗体购自美国 Sigma 公司；特异识别人干扰素 α 的鼠单克隆抗体购自美国 Calbiochem公司；重组人干扰素 α 生物学活性测定国家标准品购自中国药品生物制品检定所；毕赤酵母菌宿主蛋白检测试剂盒为美国 Cygnus 公司产品；Dig-DNA 标记试剂盒为美国 Roche 公司产品；改进型 Lowry 法蛋白含量检测试剂盒为美国 Pierce公司产品；细菌内毒素检测试剂盒为中国湛江安度斯生物有限公司产品；糖蛋白染色试剂盒为美国Thermo 公司产品。

1.1.2 仪器 LC-10Avp Plus 高效液相色谱仪为为日本岛津公司产品；TSK-GEL/G2000SWXL 色谱柱（7.8 mm × 300 mm）购自日本 Tosoh 公司；气相色谱仪（Agilent 6890N）和火焰离子化检测器（FID）为美国 Agilent 公司产品；全自动控制 200 L发酵罐系统为中国江苏镇江东方生工公司生产。

1.2 方法

1.2.1 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 表达酵母工程菌株的构建 采用常规的基因克隆和 PCR 技术，分别扩增人血清白蛋白基因和人干扰素成熟肽基因片段先后插入转移载体质粒 DNA 中。带有分泌肽的人血清白蛋白基因全 DNA 序列的毕赤酵母菌转移质粒 pAO815-HSA[17]含有 Bsu36I 和质粒 DNA 上的 XhoI 限制性内切酶位点用于干扰素 α 成熟肽基因的插入。人干扰素（IFNα2b）基因的克隆是以人白细胞中提取的总 RNA 为模板，利用 RT-PCR 技术合成和扩增获得的。干扰素 α2a成熟肽 DNA 序列的改造是使用点突变获得的。人干扰素成熟肽的 N 端与人血清白蛋白成熟肽的C 端之间直接无缝基因融合，获得 pAO815-HSA/IFNα2b 转移质粒。pZY-HSA/IFNα2a 转移质粒则含有 Zerocin 抗生素活性基因，可以生长在含有Zerocin 的 MD 培养基中。含有全融合蛋白基因序列的转移质粒 DNA，通过电脉冲转导与毕赤酵母菌 GS115 菌株染色体 DNA 同源序列间发生重组，将转移质粒中的表达组盒重组在酵母菌染色体上。具体 DNA 克隆程序和所用的合成 HSA、hIFNα2a 和 hIFNα2b 的 DNA 引物序列等参见文献[9]。融合蛋白基因表达启动子是酵母菌的乙醇氧化酶（AOX1），当甲醇作为酵母菌生长唯一碳源使用时，也就同时启动了融合蛋白的表达和生产。1.2.2 两种 rHSA/IFNα 工程菌种子库的建立和发酵工艺 高效表达 rHSA/IFNα 融合蛋白的毕赤酵母工程菌（rHSA/IFNα2a；rHSA/IFNα2b）按《中国药典》2005 版三部[18]的《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》要求制备主种子库和工作种子库。菌种稳定性经连续传代 30 次来验证目的蛋白的表达水平变化。随机选取工程菌菌落 50 个，采用 PCR 方法验证目的蛋白基因序列是否有阳性反应。工作种子经二级种子培养扩增 36 h后，接种于 200 L 发酵罐中，采用常规无机盐培养基或改进的优化无机盐培养基进行酵母菌菌体的生长和扩增（约 24 h），待菌体湿重达到 350 ～ 400 g/L 时启动甲醇流加，进入融合蛋白的诱导生产阶段（约48 ～ 72 h）。甲醇和溶氧浓度均控制在适当数值条件，发酵工艺基本参照方法[17]。

1.2.3 rHSA/IFNα 的分离纯化工艺 发酵结束后，发酵液经板框过滤或连续流离心机将上清液和菌体分离。上清液经 0.22 μm 滤芯除去不溶物和颗粒状物质后，利用蠕动泵将含融合蛋白的上清液，直接上经平衡液（25 mmol/L NaAc，pH 5.0）平衡的含 Capto-MMC介质的层析柱，上样后用平衡液再平衡；使用缓冲液（50 mmol/L PB，pH 7.0）将杂蛋白洗脱，缓冲液（50 mmol/L PB，pH 7.0，0.6 mol/L NH4Cl）将融合蛋白洗脱，纯度达 80% 以上；融合蛋白进一步经疏水性介质（HIC）纯化，使之纯度达 95% 左右；融合蛋白再进一步经离子交换层析填料做进一步精纯，而后使用分子筛介质换液，获得纯度达 98% 以上的融合蛋白，作为注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α 融合蛋白的原料药（原液）。rHSA/IFNα 的分离纯化工艺基本参照方法[15]。原液的蛋白含量测定采用文献[18]附录VIB 蛋白质测定法第二法 Lowry 法或改进型Lowry 试剂盒进行测定。原液中的细菌内毒素测定采用文献[18]附录 XIIE 细菌内毒素检查法中的凝胶法，检测细菌内毒素试剂盒的鲎试剂标定灵敏度为 0.25 EU/ml。

1.2.4 rHSA/IFNα 免疫学鉴别 纯化制备的rHSA/IFNα 按文献[18]附录 VIII A 免疫印迹法和VIII B 免疫斑点法进行两种抗体的分别鉴别，第一抗体稀释比为 300 ～ 1000 倍，第二抗体（荧光标记抗体）的使用则按出品单位操作说明书执行。

1.2.5 rHSA/IFNα 的体外细胞学生物活性测定 rHSA/IFNα.的体外细胞学生物活性采用细胞病变抑制法[19]进行测定。干扰素具有可以保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的 WISH 细胞染色，于波长 570 nm 处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH 细胞的保护效应曲线，以此测定重组人血清白蛋白/干扰素 α 融合蛋白（rHSA/IFNα）生物学活性。

1.2.6 rHSA/IFNα 纯度分析

1.2.6.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE） rHSA/IFNα 原液的电泳纯度测定采用非还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行测定。分离胶浓度为 7.5%，上样量 10 μg（考马斯亮蓝R250 染色），对电泳结果用扫描仪成像，应用分析软件分析各条带的百分比，计算目的蛋白所占百分比。

1.2.6.2 凝胶分子排阻-高效液相法（SECHPLC） 采用凝胶分子排阻-高效液相法（SECHPLC）对干扰素融合蛋白进行纯度检测。高效液相色谱仪以 50 mmol/L PB，0.1 mol/L NaCl 缓冲液（pH 7.0）为流动相，在室温条件下，进行洗脱。上样量不低于 10 μg，检测波长为 214 和 280 nm双波长。以 rHSA/IFNα 色谱峰计算理论塔板数应不低于 1000。按面积归一化法计算，rHSA/IFNα 峰面积要求不低于总面积的 95.0%。

1.2.7 rHSA/IFNα 分子量测定

1.2.7.1 还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶的分离胶浓度为 10%，上样量为1 μg。经考马斯亮蓝 R250 染色，对电泳结果用扫描仪成像，应用分析软件以已知分子量标准品各条带的相对迁移率距离制作直线回归，根据目的蛋白的迁移率距离带入直线回归方程计算出 rHSA/IFNα 分子量。

1.2.7.2 质谱法 rHSA/IFNα 质谱分子量的测定由北京蛋白质组研究中心承担。使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪进行检测，检测条件：N2激光源，波长 337 nm；检测方式：正离子，线性方式（飞行管长 1.5 m，加速电压 20 kV），基质：SA。检测到的多肽分子量与 rHSA/IFNα 各自的氨基酸序列的理论分子量进行比较。

1.2.8 圆二色光谱分析 rHSA/IFNα 的圆二色光谱测定工作由中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点研究室承担。对照品 rhIFNα2a 和rhIFNα2b 为本室利用重组大肠杆菌表达，经纯化获得的；rHSA 为本室制备的经毕赤酵母工程菌表达和纯化，纯度为 99.9%。

1.2.9 甲醇和甘油残留量测定 气相色谱仪和火焰离子化检测器用于甘油和甲醇检测，方法为毛细管柱顶空进样等温法[20-21]，以不同量甲醇或甘油作为标准品参照，每个量点连续进样 2 次，测量参照标准品溶液的峰面积，记录色谱图。待测样品则按相同方法进样和测定，根据用标准品制备的曲线，计算出待测样品中的甘油或甲醇含量（残留量）。甲醇的残留量测定也采用了变色酸比色法[22]进行比较。

1.2.10 宿主蛋白和外源性 DNA 残留量测定 毕赤酵母菌的宿主蛋白质残留量测定使用检测试剂盒进行测定。毕赤酵母菌的外源性 DNA 残留量测定，采用自制提取的毕赤酵母菌总 DNA，利用Dig-DNA 标记试剂盒制备毕赤酵母菌的总 DNA探针。rHSA/IFNα 原液中残留的外源性 DNA 经变性为单链 DNA 吸附于固相膜上，在一定温度下与相匹配的单链 DNA 探针标记复性而杂交结合为双链 DNA，并使用相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性 DNA 对照比对后，给出待测原料药（原液）中的外源性 DNA 残留量数值。

1.2.11 rHSA/IFNα 化学特性

1.2.11.1 N 端氨基酸序列分析 rHSA/IFNα 的N 端前 15 个氨基酸序列测定由北京大学生命科学学院按 Edman 降解法进行测定。适量 rHSA/IFNα 原液样品处理后对纯水充分透析，转移至经预处理的 PVDF 膜上，干燥后直接在蛋白质 N 端氨基酸测序仪按标准测定方法测定。

1.2.11.2 等电点分析 rHSA/IFNα 的等电点测定采用常规的等电聚焦垂直板电泳法测定。根据标准品的等电点（pI）对其相应的迁移率距离作直线回归，将 rHSA/IFNα 的迁移距离代入直线回归方程，求出待测样品的等电点。

1.2.11.3 糖基化分析 rHSA/IFNα 原液和糖蛋白阳性对照品，辣根过氧化物酶糖蛋白和重组人促红细胞生成素（rhEPO）、糖蛋白阴性对照大豆胰蛋白酶抑制因子一起进行 SDS-PAGE 分离，按糖蛋白染色试剂盒说明书操作，进行糖蛋白染色的电泳胶在扫描仪上扫描，再用考马斯亮蓝 R250 复染，扫描成像。

1.2.11.4 紫外光谱测定 rHSA/IFNα 的紫外光谱测定以 10 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.5）为空白对照液，在常规紫外可见分光光度计上对rHSA/IFNα 原液稀释样品（用空白对照液稀释至0.1 mg/ml）进行 450 ～ 260 nm 波长的连续扫描，测定其最大吸收波长位置。

1.2.11.5 自由巯基测定 自由巯基测定采用质谱分子量测定方法，由北京蛋白质组研究中心进行测定。将经烷基化处理封闭自由巯基和未经处理的同一来源 rHSA/IFNα 原液按 1.2.7.2 描述的质谱分子量测定方法进行比较，每一个烷基的分子量为59 D。

1.2.11.6 肽谱（RP-HPLC 法和肽质量指纹质谱法）

①胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法：取rHSA/IFNα 原液稀释至 1 mg/ml，用 1% 碳酸氢铵溶液充分透析，以终浓度 0.01 mol/L 二硫苏糖醇（DTT）在 56 ℃ 下还原 60 min，以终浓度0.055 mol/L 碘乙酰胺室温避光烷基化 30 min，按1∶50（mg/mg）加入胰蛋白酶溶液［取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的（或序列分析纯）胰蛋白酶适量，加 1% 碳酸氢铵溶液溶解，制成 0.1 mg/ml的溶液］到供试品溶液中，在 37 ℃ 保温酶切 24 h后，按 1∶10 加入 50% 醋酸溶液，以 10 000 ×g离心 5 min（或通过 0.45 µm 膜过滤），精密量取上清液 100 μl，注入高效液相色谱仪，流动相及洗脱程序为：A 液为 0.1% 三氟乙酸-水溶液，B 液为0.1% 三氟乙酸-乙腈溶液。以流速为 1 ml/min，梯度洗脱 70 min（A 液从 100% ～ 30%，B 液从 0 ～70%），检测波长为 214 nm，记录色谱图。

②激光质谱肽质量指纹图谱的测定：使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪进行检测，由北京蛋白质组研究中心承担。取待测样品10 μl（10 μg），加入 10 μl 100 mmol/L NH4HCO3溶液，加入 100 mmol/L DTT 至终浓度 10 mmol/L，56 ℃ 反应 1 h。冷却至室温后，加入250 mmol/L 3-吲哚乙酸（IAA）至终浓度 25 mmol/L，避光反应 1 h。加入 0.5 μg Trypsin，37 ℃ 反应 12 h。将上述酶切产物与基质按 1∶3 混合点于靶上，自然晾干后，反射正离子模式（m/z 500 ～ 5 000）和线性正离子模式（m/z 3 000 ～ 20 000）下测定肽质量指纹谱（PMF），以已知 rHSA/IFNα2a或 rHSA/IFNα2b 氨基酸序列肽段理论分子量进行比对。

2 结果

2.1 rHSA/IFNα 工程菌的构建和表达产物

图 1 重组人血清白蛋白/干扰素 α 融合蛋白成熟肽氨基酸序列Figure 1 The amino acid sequences of mature peptide of recombinant human serum albumin/interferon-α fusion protein(rHSA/IFNα2a)

利用基因工程技术构建的毕赤酵母工程菌种表达重组人血清白蛋白/干扰素 α2a 融合蛋白（rHSA/IFNα2a）成熟肽的理论氨基酸序列为图 1。由毕赤酵母菌工程菌表达的 rHSA/IFNα2b 与rHSA/IFNα2a 的成熟肽氨基酸序列仅在第 23 位不同。分泌到发酵液中的融合蛋白是可溶性的蛋白质，具有 750 个氨基酸。rHSA/IFNα2a 的理论计算分子量为 85694.50 D，等电点为 pI 5.845；rHSA/IFNα2b 的理论计算分子量为 85722.52 D，等电点为 pI 5.845。共有 19 个二硫键，分别为53-62，75-91，90-101，124-169，168-177，200-246，245-253，265-279，278-289，316-361，360-369，392-438，437-448，461-477，476-487，514-559，558-567，586-683（1hIFNα98），614-723（29hIFNα128）。HSA 的第 34 个半胱氨酸（C）有一个游离的自由巯基。研究结果表明，在正确构象下 HSA 或rHSA/IFNα 的该 34 C 不会与的另一个 HSA 分子或另一个 rHSA/IFNα 分子之间的自由巯基形成共价二硫键，这是因为第 34 位的半胱氨酸被包裹在 HSA 分子内部，两个 HSA 分子之间不会形成共价二硫键形式的二聚体，仅可形成电荷相吸形式的聚合体。研究表明在 rHSA/IFNα 中的干扰素 α的两个共价二硫键形成正常，没有在形成融合蛋白时受到 HSA 大分子的影响，表明 rHSA/IFNα 的蛋白分子结构稳定。

2.2 rHSA/IFNα 的大规模发酵工艺的建立

对表达 rHSA/IFNα 的 2 个工程菌进行主种子库和工作种子库的建立和检定使之符合国家对生物制品生产用菌种的要求。随机选取 50 个工程菌菌落，进行目的基因 PCR 检测，为 100% 阳性。酵母重组工程菌经连续 30 个代次的传代，目的蛋白表达水平稳定与原始菌种相同。采用 5、30 和200 L 不同规模的发酵系统进行工程菌的发酵测试和优化，确定了 rHSA/IFNα 毕赤酵母工程菌在200 L 规模的发酵工艺。融合蛋白分泌到酵母细胞外的培养液中，取发酵上清液 10 ～ 30 μl 进行还原和非还原的 SDS-PAGE 分析结果显示，发酵上清液中总蛋白（不低于 1 g）的 40% 以上是 rHSA/IFNα 单体融合蛋白目的产物（图 2A，B）。可以确定毕赤酵母工程菌株的 rHSA/IFNα 表达水平均不低于 300 mg/L。两者的表达水平没有显著差异。发酵工艺稳定，且可线性放大、无机盐培养基配方组分简单、成本低廉可满足今后产业化的要求。

2.3 rHSA/IFNα 蛋白质的分离纯化

发酵结束后，进行 pH 和电导率值调整，上清液经 0.22 μm 柱状滤芯过滤处理后，经介质填料的连续分离和纯化。精纯获得 rHSA/IFNα 溶液，按改进型 Lowry 法测定，蛋白质含量在 5 mg/ml 左右，细菌内毒素含量在 1 EU/ml 以下。制备的rHSA/IFNα 溶液符合生物制品的要求，可以作为《注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α2a 融合蛋白》或《注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α2b 融合蛋白》的原料药（原液）。

图 2 在 200 L 发酵罐中毕赤酵母工程菌经甲醇诱导表达重组人血清白蛋白/干扰素 α 融合蛋白，rHSA/IFNα2a（A）和 rHSA/IFNα2b（B）Figure 2 Expression of rHSA/IFNα by Pichia pastoris from a 200 L bioreactor (fermenter)

2.4 rHSA/IFNα 免疫鉴别

rHSA/IFNα 是由白蛋白和干扰素 α 蛋白质两个分子融合组成的。免疫印迹试验结果显示，特异识别人血清白蛋白的单克隆抗体与 rHSA/IFNα 有特异的免疫学反应，也与作为阳性对照品的血源人血清白蛋白（pHSA）和酵母菌表达的重组 HSA（rHSA）有免疫反应，但不与阴性对照品人干扰素（rhIFNα）有免疫反应；特异识别人干扰素的单克隆抗体则与 rHSA/IFNα 和阳性对照品重组人干扰素（rhIFNα）有免疫特异反应，但不与阴性对照品pHSA 和 rHSA 有特异反应（图 3A、B）。免疫斑点法可以获得相同的鉴别结果。

2.5 rHSA/IFNα 的体外细胞学生物活性测定

rHSA/IFNα 原液的体外细胞学生物活性测定结果表明，作为融合蛋白的 rHSA/IFNα 的生物比活性为 2.5 × 105IU/mg，而 rhIFNα 的生物比活性为 1 × 108IU/mg。rHSA/IFNα 和 rhIFNα 的分子质量比为 4.5∶1。由此计算，在等摩尔分子时，4.5 mg 融合蛋白中有 1 mg 是 IFNα，但是 rHSA/IFNα 实测得到的体外生物活性仅有 rhIFNα 的1/400。rHSA/IFNα2a 和rHSA/ IFNα2b 两者之间的体外细胞生物活性测定值没有显著的统计学意义上的差异。

图 3 融合蛋白 rHSA/IFNα 的免疫印迹鉴别试验Figure 3 The western-blotting results come from by different first antibodies

2.6 rHSA/IFNα 蛋白质的物理特性分析

2.6.1 rHSA/IFNα 蛋白质纯度分析 取 10 μg的 rHSA/IFNα 蛋白质在非变性条件下做 SDSPAGE，结果显示分离纯化的 rHSA/IFNα 电泳纯度达 99%；凝胶分子排阻-高效液相（SEC-HPLC）在波长 280 和 214 nm 记录结果显示均为单一峰，峰面积不低于总面积的 99%。rHSA/IFNα 经SEC-HPLC 测定获得相同结果。因此，在原液中可能存在的单体 IFNα 分子、单体 HSA 分子和聚合体形式的 rHSA/IFNα 的总值不会高于 10 μg/mg。

2.6.2 分子量测定 在还原条件下以已知蛋白质分子量为参照物，进行直线回归方程计算，分子量的测定结果为（85.7 ± 8.6）KD。对 rHSA/IFNα2a理化对照品和 rHSA/IFNα2b 用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪进行测定的分子量为 85640.8 D和 85781.5 D，分别与理论分子量 85694.5 D 和85722.5 D 值相近。

2.6.3 圆二色光谱分析 应用圆二色光谱仪分别对 rHSA/IFNα2a、rIFNα2a 和 rHSA 蛋白质溶液或rHSA/IFNα2b、rIFNα2b 和 rHSA 开展远紫外光谱分析测定，对所获得的光谱曲线分别进行了叠加分析比较。在图 4A 中显示了 rHSA + rIFNα2a（蓝）、rHSA/IFNα2a（红）、rHSA（绿）和 rhIFNα2a（黑）分子间圆二色光谱叠加结果。rHSA/IFNα2b 的测试结果获得相似的图形；图 4B 中显示 rHSA/IFNα2a（蓝）和 rHSA/IFNα2b（粉）的叠加。结果表明重组人血清白蛋白/干扰素 α 融合蛋白和重组人血清白蛋白、重组人干扰素 α 理论加和的圆二色图形相似度非常高，表明在融合蛋白中的人血清白蛋白和人干扰素 α 的各自空间结构没有发生变化。结果与参考文献[13]相似。这些结果预示融合蛋白中的 HSA 和干扰素分子的空间构象没有变化。

图 4 对 rHSA/IFNα 蛋白质紫外圆二色叠加图谱分析Figure 4 Protein UV-Circular dichroism spectra (CD)analysis of rHSA/IFNα

2.6.4 甲醇和甘油残留量测定 无论采用变色酸比色法或是气相色谱法，在 rHSA/IFNα 原液中甲醇残留量都在 0.0001%（g/g）以下，远低于《中国药典》2005 版二部中对作为原料药残留溶剂-甲醇的限度要求值（0.3%）。甘油的残留量采用气相色谱法测定，其残留量低于仪器和方法检出的下限值，可以判定为未检出。

2.6.5 宿主蛋白质和外源性 DNA 残留量 采用试剂盒检测了 rHSA/IFNα 原液中的毕赤酵母菌宿主蛋白的残留量，结果表明 2 个新药原液中的酵母菌蛋白质含量均在 0.05% 以下，测定的回收率值在 70% ～ 130% 之间，符合国家对注射用重组蛋白质药物中宿主蛋白质残留量限定的要求。rHSA/IFNα 原液中的毕赤酵母菌外源性 DNA 残留量经测定，每毫克融合蛋白或临床每人次剂量小于 10 ng 的标准。

2.7 rHSA/IFNα 的化学特性

2.7.1 N 端氨基酸序列测定 2 个 rHSA/IFNα的 N 端序列前 15 个氨基酸的测定结果均为：Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly-，与 rHSA/IFNα 理论序列相符。对不同批次的 rHSA/IFNα 原液分别进行 N 端氨基酸序列测定获得相同的结果。

2.7.2 等电点 对 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b进行的等电聚焦和等电点测定结果为一个条带，等电点 pI 测定值为 5.1 左右，这与理论值（pI 5.845）相近。图 5 为连续 3 批次的 rHSA/IFNα2a 和rHSA/IFNα2b 原液等电点检定结果。

图 5 两个融合蛋白 rHSA/IFNα 的等电点测定Figure 5 Isoelectric focusing (IEF) of rHSA/IFNα fusion proteins

2.7.3 糖基化 利用高碘酸溶液处理含有蛋白的凝胶或者膜，该溶液会氧化糖蛋白上含有的顺式二元醇糖基团形成醛基基团，从而可以与特定试剂形成希夫碱键并产生品红色的条带而得到检测，称为高碘酸希夫碱（PAS）试剂法。对 5 μg 的 rHSA/IFNα 经过 SDS-PAGE 分离后使用试剂盒进行染色，比较随后的用考马斯亮蓝 R250 复染色电泳胶（图 6A、B），显示由毕赤酵母菌表达制备的 2 个rHSA/IFNα 融合蛋白均为非糖基化或低糖基化蛋白质。

图 6 毕赤酵母菌表达的两个 rHSA/IFNα 融合蛋白的糖基化程度分析Figure 6 Glycoprotein Staining and Coomassie Brilliant blue re-staining of two rHSA/IFNα .proteins on SDS-PAGE

2.7.4 紫外光谱测定 rHSA/IFNα 原液中的蛋白质呈典型蛋白质紫外吸收峰，最大吸收峰波长在278 nm 左右。

2.7.5 自由巯基测定 rHSA/IFNα2a 样品烷基化在封闭和不封闭条件下测试的质谱分子量分别为85788.4 D 和 85706.1 D，两者之差为 82.3 D，计算 82.3 D/57 D = 1.4，表明 rHSA/IFNα 中含有约1.4 个自由巯基。理论氨基酸序列中 rHSA/IFNα含有 1 个自由巯基（半胱氨酸 C）位于第 34 位。因此测定值与理论值一致。在对 rHSA/IFNα2b 开展的自由巯基测定工作获得了相同的结果。

2.7.6 肽图分析 rHSA/IFNα2a（粉色）和 rHSA/IFNα2b（黑色）经变性和烷基化后，胰蛋白酶水解获得的各自的 RP-HPLC 肽图，并在叠加后显示出绝大部分的肽图图形相似，明显不同的两个峰值则以箭头标示（图 7A），可以作为 rHSA/IFNα原液的质量鉴别指标之一。在 rHSA/IFNα2a 肽图（图 7B）中第 17 分钟左右有 1 个峰形是 rHSA/IFNα2b 中对应位置没有的峰；在 rHSA/IFNα2b 的第 24 分钟出现的 1 个峰则是 rHSA/IFNα2a 样品中没有的峰（图 7C）。这两个差异可以确定作为2 个融合蛋白 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 之间的鉴别指标。rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 各自的批次间重现率较好（图 7D 和图 7E）。

根据已知 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 的全长氨基酸序列计算出各自的理论肽谱，将实测肽质量指纹图谱与理论图谱进行比对，检出氨基酸序列的覆盖率分别为 83% 和 82%。以 rHSA/IFNα2a为例，该融合蛋白 N 端氨基酸序列完全匹配到41 个氨基酸残基；C 端匹配到 42 个残基。HSA的 C 端匹配出 112 个残基和干扰素 α2a 的 N 端匹配出 83 个残基。rHSA/IFNα2b 的 N 端氨基酸序列完全匹配出 50 个残基，C 端匹配出 52 个残基。在融合蛋白的融合位点人血清白蛋白的 C 端匹配出 11 个残基，干扰素 α2b 的 N 端则匹配出50 个残基。2 个融合蛋白直接相连的氨基酸序列部位都能清楚检出。2 个融合蛋白的 C 端最后1 个氨基酸 E 都没有匹配，是由于在其之前的氨基酸是赖氨酸（K）。赖氨酸是胰蛋白酶的酶切特异识别位点。2 个 rHSA/IFNα 融合蛋白的肽序列中氨基酸第 608 位（干扰素 α 的第 23 位）的肽序列，也能清楚地匹配，也可以作为融合蛋白 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 区别的特异性指标。

3 讨论

为表达两种融合蛋白 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b，我们分别构建了 2 个毕赤酵母工程表达菌株。经测试工程菌的基因重组可稳定传代。发酵工艺各经十余罐次不同规模的发酵制备，显示发酵工艺的稳定和可重复性。发酵培养基组分简单，适合用于大规模工业化生产重组人血清白蛋白/干扰素融合蛋白。毕赤酵母工程菌表达的融合蛋白不仅与 HSA 的特异单克隆抗体有阳性反应，也与干扰素 α 的特异单克隆抗体有特异免疫学反应。体外细胞生物学活性测定，展示出人干扰素 α 特有的抑制 VSV 病毒侵染 WISH 细胞的生物活性功能。研究观察到两个融合蛋白之间，在体外生物活性测定值上没有任何统计学意义上的差异。干扰素α 融合蛋白的生物活性与单体干扰素 α 之间相比在数据上为 1/400，考虑到分子量差异 4.5 倍，实际上融合蛋白中的干扰素 α 的生物活性下降了100 倍。rHSA/IFNα 的体外生物活性大大降低可能是由于融合蛋白中的 IFNα 分子与干扰素受体结合区域，受到融合蛋白的遮蔽。在干扰素的 N 端第 1 个氨基酸是半胱氨酸 C，其与干扰素的第 98位的半胱氨酸 C 需要形成 1 个二硫键来构成干扰素 α 的关键空间结构。干扰素 α 与 HSA 融合并没有影响到这个关键二硫键的形成，干扰素的空间结构也没有发生变化，但干扰素与受体结合的能力大大降低，这导致了干扰素融合蛋白体外生物活性下降。我们已完成的动物试验和文献报道的带有连接肽[14]和不带有连接肽[13]的人血清白蛋白与干扰素 α2b 形成的融合蛋白，在动物体内和临床上患者体内抗病毒的能力并没有下降，显示融合蛋白中的干扰素在人和动物体内并没有受到 HSA 大分子的空间构型的干扰和影响。

图 7 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 的还原型-烷基化胰蛋白酶酶解 RP-HPLC肽图图谱分析[A：rHSA/IFNα2a（粉色）和rHSA/IFNα2b（黑色）的肽图叠加；B：rHSA/IFNα2a（粉色）在第 17.5 min 的一个特有区别峰；C：rHSA/IFNα2b 在第 24.8 min 时的一个特有区别峰；D：rHSA/IFNα2a 两个批次 9213Y20090501（黑色）和 9213Y20081003（粉色）间的比较；E：rHSA/IFNα2b 两个批次9216Y20100502（黑色）和9216Y20100503（粉色）间的比较]Figure 7 The RP-HPLC peptide mapping of fusion proteins rHSA/IFNα2a and rHSA/IFNα2b compares under reducing condition and enzymatic digestion.[A: Mapping pile up of rHSA/IFNα2a (pink) and rHSA/IFNα2b (black); B: Identify peak at 17.5 min for rHSA/IFNα2a (pink); C: Identify peak at 24.8 min for rHSA/IFNα2b (black); D: Mapping from different Batches of rHSA/IFNα2a,9213Y20090501(black) and 9213Y20081003 (pink); E: Mapping from different Batches of rHSA/IFNα2b, 9216Y20100502(black)and 9216Y20100503]

从不同时间的大规模发酵诱导表达融合蛋白的结果可以看出，随着诱导时间的延长，酵母菌分泌的目的蛋白在发酵液中获得积累，增加上清液中融合蛋白的含量。同时，观察表明目的蛋白表达产物（rHSA/干扰素 α）也还是有被降解的现象存在。融合蛋白的降解物存在，会对下游目的蛋白的分离纯化有直接影响。因为目的蛋白降解物是和目的蛋白具有相同的肽段，亲和层析介质和疏水介质（HIC）在特异结合目的蛋白上的特定肽段时，会受到竞争性结合影响。为此，虽然延长生产时间，融合蛋白单位产量会有十分显著地增加，但是可能会为下游的纯化带来困难，因此可以限定诱导 72 h左右时，结束发酵进入分离纯化程序。通过 2 个融合蛋白的分离纯化工艺优化，并经多批次的验证，发酵和纯化工艺稳定可靠，且可线性放大。融合蛋白 rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b 原液符合临床用药对原料药纯度的要求。

对两个融合蛋白的理化特性分析表明，经分离纯化的融合蛋白在物理特性分析中显示，在SDS-PAGE 电泳、凝胶分子排阻-高效液相（SECHPLC）测定中均呈单一峰；对原液中的甲醇、甘油、毕赤酵母菌宿主蛋白质和外源性 DNA 残留量的测定方法的建立和检定结果表明两个 rHSA/IFNα 原液的蛋白质纯度分析结果可靠。对 rHSA/IFNα 的化学特性分析结果表明紫外吸收测定显示具有蛋白质特定的紫外吸收峰值；等电点和分子量测定结果也符合理论计算值；远紫外区圆二色 CD光谱主要反映蛋白质肽键的圆二色性，辨识蛋白质的二级和三级结构。而圆二色光谱分析证明融合蛋白中的 HSA 和干扰素 α 各自的空间结构没有因为形成融合蛋白而发生错配，它们维持了各自的二硫键正确配对；应用RP-HPLC 技术建立的肽图分析方法简单，可以作为与理化对照品或批次间原液生产制备的鉴别手段之一，还可以作为两个融合蛋白的鉴别方法。肽质量指纹质谱分析结果，显示83% 的 rHSA/IFNα2a 和 82% 的 rHSA/IFNα2b氨基酸肽段可以被检出，包括融合蛋白的 N 端、C 端、HSA 和 IFNα 连接部位的氨基酸序列。同时，决定是干扰素 α2a 或 2b 药物分子的单一氨基酸差异也可以清楚地鉴别。肽质量指纹图谱简单、可重复，是区别两者的最好和可靠的方法。虽然融合蛋白的 C 端的氨基酸 E 未能匹配，但是rHSA/IFNα2a 质谱分子量测定结果 85640.8 D 与理论分子量 85694.5 D 之间的差异为 53.7 D，其远远小于谷氨酸的理论分子量 147.1 D。同理，对rHSA/IFNα2b 测定的结果相似，也可以获得解释。N 端蛋白质序列测定也再次证明由酵母菌分泌出的融合蛋白，切割加工过程正确，获得的融合蛋白是单一肽序列结构，蛋白质分子完整。

对比文献[11-12]使用酿酒酵母表达的 rHSA/IFNα2b 和 rHSA/GCSF 融合蛋白，我们使用毕赤酵母来表达 rHSA/IFNα2b 要有较明显的优势，首先是表达量要高 10 ～ 100 倍，其次融合蛋白被酵母糖基化水平也要低得多。使用毕赤酵母菌进行rHSA/IFNα 的生产和制备，在纯化的原料药中含有多少热源（由后处理过程中污染而来的）、宿主蛋白质、外源性 DNA、甲醇和甘油残留量（杂质）是需要确定的，以保证在临床用药时，不会由于这些残存的宿主物质而带来临床上的异源蛋白刺激反应。

rHSA/IFNα 的发酵生产制备过程中使用的培养基中含有甘油，作为碳源。理论上，甘油在酵母菌生长和扩增过程被完全消耗后，才转为使用甲醇作为碳源和重组融合蛋白的表达诱导剂。为了用药完全，有必要对 rHSA/IFNα 原液样品中的甘油和甲醇残留量进行检测。

通过研究，我们对两个融合蛋白的理化特性所开展的独立研究，获得了十分有益的数据和试验结果，也获得了区别这两个融合蛋白的技术方法和指标。本研究的检定方法和指标可以作为指导具长效性的《注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α2a 融合蛋白》和《注射用重组人血清白蛋白/干扰素 α2b 融合蛋白》原料药制造和检定质量标准规程建立的依据。

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Expression and the physical and chemical characterizations studies of two recombinant human serum albumin/interferon-α (2a; 2b) fusion proteins with long-acting bio-function

FU Yan, HAN Guo, YANG Xiao-nan, FU Yu-song, XING Jing, HU Jun-xin, CHEN Ying, Yun Wen-qi, YU Zai-lin

ObjectiveTo analyze and compare the physical and chemical characterizations of recombinant human serum albumin/interferon alpha-2a fusion protein and recombinant human serum albumin/interferon alpha-2b fusion protein drugs.

MethodsThe genetically engineered yeastPichia pastorisstrains used in the expression of rHSA/IFNα2a or rHSA/IFNα2b fusion proteins were constructed separately.The fusion protein was directly secreted by yeast into a simple non-organic culture medium,then purified by three-step highly-efficient chromatography.The physical and chemical characterizations of the highly purified drug-level fusion proteins were investigated in detail.

ResultsCharacterization analysis results from the two fusion proteins were obtained including protein purity, which is more than 98%.The first 15 amino acids of the N-terminal sequence of the fusion protein match that of the predicted sequence, with the molecular mass of Maldi-TOF/TOF spectrum being 85788.4D and 85706.1D for rHSA/IFNα2a and rHSA/IFNα2b, respectively.UV-circular dichroism (CD) spectra is not different compared with HSA or interferon-α, and fusion protein’s IEF (pI) is around 5.1.The fusion proteins are non-glycoprotein with staining, and UV-wavelength specification shows typical protein spectroscopy.Measurement of free-sulfhydryl (SH) group matchs the predicted value; and mass spectrometric peptide mapping shows 83% or 82%identity to the predicted peptide fragments, respectively.The residues in the bulk preparations are also investigated and meet the standard requirement, including the endotoxin, host protein, exogenous DNA, methanol and glycerol.The immune-identification is positive and the anti-virus bio-assayin vitrois 2.5 × 105IU/mg, with no difference seen between two fusion proteins.

ConclusionsThe methods used and results obtained from this study may be used as qualification standards in making the clinically available final products of long acting interferon-α protein drugs, “Recombinant human serum albumin/interferona2a fusion protein for injection” and “recombinant human serum albumin/interferona2b fusion protein for injection”.

Interferon-αlpha; Long-acting interferon; Serum albumin;Pichia; Recombinant fusion proteins

YU Zai-lin, Email: zyu88@yahoo.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.002

北京市海淀区科学技术委员会项目支持资金（K20100133Z）；天津市科学技术委员会项目支持资金（07ZCKFSH02400）；国家 863 计划重大科技攻关（2007AA021604）；国家“重大新药创制”专项（2009ZX09301-008N20）

100085 北京美福源生物医药科技有限公司（富岩、韩国、邢静、于在林）；300457 天津林达生物科技有限公司（富岩、杨小楠、陈颖、胡俊霞、于在林）；300457 天津溥瀛生物技术有限公司（富俞淞、云文琦、于在林）

于在林，Email：zyu88@yahoo.com

2011-03-07

Author Affiliations: Beijing Bio-Fortune Ltd, Beijing 100085, China (FU Yan, HAN Guo, XING Jing, YU Zai-lin); Tianjin Sino-Biotech Ltd, Tianjin 300457, China (FU Yan, YANG Xiao-Nan, CHEN Ying, HU Jun-xia, YU Zai-lin); Sino-Biotech (Tianjin)Ltd, Tianjin 300457, China (FU Yu-Song, YUN Wen-qi, YU Zai-lin)

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