沈阳,张书红,汤亭亭
不同来源成体干细胞BMP-2基因转染并微囊化后细胞活性及分泌量观察
沈阳,张书红,汤亭亭
目的比较不同来源成体干细胞 BMP-2 基因转染并微囊化后的存活情况,并检测分泌至微囊外的 BMP-2 蛋白数量。
方法从大鼠的骨髓、脂肪和滑膜组织内分离培养不同类型的成体干细胞:骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪干细胞(ADSCs)和滑膜干细胞(SMSCs)。利用高压静电装置制备海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)标记细胞在微囊内的存活情况。利用含有 BMP-2 基因的重组腺病毒感染不同来源的成体干细胞后微囊化包裹,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测分泌到微囊外的 BMP-2 蛋白量。
结果包裹 4 周后荧光显微镜观察发现,BMSCs、ADSCs和 SMSCs 可在微囊内长期存活。ELISA 检测发现,3 种转基因细胞在微囊化后都可以持续分泌 BMP-2 蛋白,其中BMSCs 分泌最多,在第 2、3、4 周和其他 2 种细胞相比有明显差异(P< 0.01)。
结论3 种来源的成体干细胞都可以作为 BMP-2 基因给药促进骨再生研究的候选细胞,其中以骨髓来源的间充质干细胞为首选。
成体干细胞; 骨形态发生蛋白质类; 基因转移技术
大段骨缺损、骨延迟愈合和不愈合是目前骨科临床治疗的难点。通过移植携带生物活性分子基因的细胞来促进组织愈合的组织工程方法为解决这一难题提供了新的治疗前景。由于自体细胞的应用存在培养时间长、不能应用于急诊患者等缺点,非自体细胞的移植受到了广泛重视。在既往的研究中,我们已确立了一种利用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊包裹基因转染成体干细胞的方法,证实微囊可对非自体细胞起到免疫隔离作用,目的蛋白也可持续释放到微囊外产生生物学效应[1-2]。
在前述研究中我们应用的是骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)作为基因转染的靶细胞,而在目前的组织工程研究中,脂肪来源的干细胞(ADSCs)和滑膜来源的干细胞(SMSCs)也得到了广泛应用[3-4]。因此本研究试图比较骨髓、脂肪、滑膜三种不同来源的干细胞(BMSCs、ADSCs 和SMSCs)在微囊化包裹后的存活情况,以及 BMP-2基因转染后这些细胞分泌到微囊外的目的蛋白数量,以期为骨再生的微囊化基因给药研究提供一种最适宜的细胞。
1.1.1 实验动物 SPF 级 SD 大鼠,雄性,8 周龄,由上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心购置。动物生产和使用许可证号码分别为SCXK(沪)2007-0005 和 SYXK(沪)2007-0007。
1.1.2 试剂和仪器 αMEM 及 DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司;胎牛血清(FBS)购自美国 Hyclone 公司;1% 双抗(100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素)购自美国 Hyclone 公司。海藻酸钠(批号 032K01911,黏度 0.25 Pa.s)和聚赖氨酸(批号 033K5118)购自美国 Sigma 公司。BMP-2 ELISA 试剂盒(批号 271868)购自美国 R&D 公司;含有 GFP 标记基因的重组腺病毒 Adv-GFP购自美国 Invitrogen 公司;含有 BMP-2 基因的重组腺病毒 Adv-BMP2 由上海生化制品所楼觉人教授提供。
图 1 不同来源成体干细胞的形态(倒置显微镜 × 40)Figure 1 The morphology of different tissue derived adult stem cells with the appearance of colony forming unit (inverted microscope × 40)
1.2.1 SD 大鼠 BMSCs、ADSCs 和 SMSCs 的分离与培养 采用参考文献[5]的方法,取大鼠股骨骨髓,稀释于 10 ml 含 100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素、10% 胎牛血清的 αMEM 培养液中,通过贴壁培养法分离培养 BMSCs。ADSCs的分离培养根据文献[6]的方法,切取大鼠双侧腹股沟皮下脂肪垫,加入 0.1% I 型胶原酶消化 1 h获取细胞,接种于含 10% 胎牛血清的 αMEM 培养液中培养。SMSCs 的分离与培养参照文献[7]的方法,切取大鼠膝关节内滑膜加入 0.25% 胰酶消化 5 min,II 型胶原酶消化 3 min 获取细胞,接种于含 10% 胎牛血清的 αMEM 培养液中培养。
1.2.2 包裹细胞的微囊制备 在电压 3 kV、液面距 25 mm、推进速度 30 mm/h 的高压静电场成囊装置中,将含有 3 × 106/ml个细胞的细胞悬液与1.75% 的海藻酸钠溶液组成的混合液滴入 0.1 mol/L氯化钙溶液中形成海藻酸钙微粒,再与 0.05% 聚赖氨酸溶液反应 6 min 使微粒外包裹一层聚赖氨酸,加入 0.15% 海藻酸钠溶液中和微粒表面电荷,最后用 55 mmol/L 柠檬酸钠溶液置换出微粒核心中的钙离子得到微囊。所得微囊置无菌培养皿中,加入 DMEM 培养液 10 ml,37 ℃、5% CO2中培养待用。
1.2.3 Adv-GFP 基因转染和微囊内细胞活力观察 分别取 3 种细胞的第 2 代感染 Adv-GFP,每皿细胞生长到全皿的 90% 后,加 1 ml Adv-GFP过夜(MOI = 150),再采用 1.2.2 的方法进行微囊包裹,于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。微囊化 1 ~4 周后分别在荧光显微镜下观察,通过绿色荧光判断细胞的存活情况。
1.2.4 BMP-2 基因转染和微囊外基因产物测定 同样取 3 种细胞的第 2 代感染 Adv-BMP2,每皿细胞生长到全皿的 90% 后,加 2 ml Adv-BMP2过夜(MOI = 100)。取 3 × 106个感染细胞微囊化后置于 15 ml 的培养皿中,于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。包裹后第 1 ~ 4 周每 2 天收集微囊外的上清液保存,分别汇合收集每周累计上清液,利用 BMP-2 ELISA 试剂盒并参照说明书的实验步骤进行检测。BMP-2 蛋白的分泌量通过标准曲线计算得出。
应用 SAS612 统计学软件进行数据处理。组间细胞 BMP-2 蛋白的分泌量应用单因素方差分析进行统计,以P< 0.05 为差异有统计学意义。
图 1 显示,三种细胞都可以形成集落单位,其中 BMSCs 呈长梭形,而 ADSCs 和 SMSCs 呈短梭形。
图 2 显示,我们制作的包裹或不包裹细胞的微囊的形态大小基本一致。图 3 是 GFP 标记的BMSCs 在荧光显微镜下的照片,包裹干细胞的微囊大小基本一致,表面光滑,直径大约在 200 μm左右。包裹后 1 周和 4 周时观察发现,3 种微囊化 GFP 标记细胞在荧光显微镜下均可见绿色荧光,证实细胞仍然存活。ADSCs 和 SMSCs 微囊化后形态和微囊内细胞的存活与 BMSCs 一致。
图 2 海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊的形态(倒置显微镜 × 100)Figure 2 The morphology of alginate-poly-L-lysine-alginate microcapsules (inverted microscope × 100)
图 3 GFP 标记的 BMSCs 在微囊内的存活情况(倒置荧光显微镜 × 400),包裹后 1 周(A)和 4 周(B)可见微囊内有绿色荧光标记细胞Figure 3 The viability of GFP labeled BMSCs in the microsapsule at 1 week (A) or 4 weeks(B) after encapsulation indicated by the green fluorence in the micrograph (inverted fluorescence microscope × 400)
图4 未转染 BMP-2 基因的 3 种成体干细胞,微囊化后BMP-2 蛋白的基础分泌量Figure 4 The basic BMP-2 secretion from the microencapsulated cells without BMP-2 gene transfer
图5 微囊化基因转染细胞的 BMP-2 蛋白分泌(P < 0.01)Figure 5 All encapsulated BMP-2 gene-transfected stem cells were capable of constitutive secrete BMP-2 proteins (P < 0.01)
本研究采用的微囊化技术是将细胞包封在高分子材料形成的选择性透过膜中,这种透过膜可使小分子的营养物质、囊内活性物质及代谢产物自由出入,防止大分子的免疫球蛋白和免疫细胞的通过,起到免疫隔离作用。微囊内的材料还可延缓生物活性物质的释放,有利于其在较长时间内发挥作用。1980年,加拿大多伦多大学的 Lim 和 Sun[8]发明了海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸(APA)微胶囊,并把猪的胰岛细胞微囊化,移植入糖尿病大鼠体内,结果表明该人工细胞成功地调节了血糖水平。后来人们又开始将微囊化技术和基因治疗结合,形成微囊化基因给药技术,即利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病,其中大多数研究集中在神经退行性疾病的治疗上[9]。
随着干细胞和再生医学研究的发展,人们开始利用微囊来包裹胚胎干细胞,研究微环境对干细胞分化的影响[10]。在前期研究中,我们尝试用微囊来包裹成体干细胞[1-2,11],证实微囊可对非自体骨髓来源的 BMSCs 细胞起到免疫隔离作用,BMP-2 蛋白也可持续释放到微囊外产生生物学效应。本研究则进一步证实,APA 微囊也可用于包裹脂肪来源和滑膜来源的干细胞 ADSCs 和 SMSCs,并作为BMP-2 基因给药研究的候选细胞。同时我们也发现微囊化细胞分泌的 BMP-2 蛋白量随着时间延长逐渐减少,这可能与细胞在微囊内的存活量逐渐减少有关,也可能与腺病毒的表达周期有关。虽然我们制备的微囊能使细胞在囊内长期存活,但是由于微囊制备材料的生物相容性有待提高、微囊机械强度的不足、微囊壁渗透性不良以及机体免疫细胞对微囊内细胞的杀伤作用等,体内移植仍然面临微囊内细胞存活时间短、炎性细胞浸润和纤维化包裹的难题[12]。微囊制备材料的选择以及微囊制备技术的改进还有很大的空间。
目前已有很多文献比较肌肉骨骼系统不同来源干细胞在增殖和多向分化能力方面的差异。Hayashi等[13]比较了大鼠骨髓、骨膜、脂肪来源的干细胞的成骨潜能,发现骨髓和骨膜来源细胞的成骨能力优于脂肪来源细胞,而体内异位成骨研究提示骨髓 MSCs 可形成最多的骨组织。Yoshimura等[14]从大鼠骨髓、骨膜、脂肪和肌肉等组织分离培养间充质干细胞,结果发现骨膜和肌肉来源的细胞成骨能力最强。这些结果提示不同来源的干细胞在成骨潜能上有一定的差异。我们的研究结果提示,BMSCs 在转基因后产生 BMP-2 蛋白的效率最高,由此我们认为 BMSCs 可以作为今后微囊化基因给药平台促进骨再生研究的首选细胞。
[1]Ding HF, Tang TT, Liu R, et al.In vitro study of BMP-2 gene transfected bone marrow derived mesenchymal stem cells in APA microcapsules.Chin J Exp Surg, 2007, 24(1):69-71.(in Chinese)
丁惠锋, 汤亭亭, 刘荣, 等.包裹骨形态发生蛋白-2基因转染干细胞的微囊化方法和蛋白释放效应.中华实验外科杂志, 2007, 24(1):69-71.
[2]Ding HF, Liu R, Li BG, et al.Biologic effect and immunoisolating behavior of BMP-2 gene-transfected bone marrow-derived mesenchymal stem cells in APA microcapsules.Biochem Biophys Res Commun, 2007, 362(4):923-927.
[3]Li H, Dai K, Tang T, et al.Bone regeneration by implantation of adipose-derived stromal cells expressing BMP-2.Biochem Biophys Res Commun, 2007, 356(4):836-842.
[4]De BariC, Dell’Accio F, Tylzanowski P, et al.Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane.Arthritis Rheum, 2001, 44(8):1928-1942.
[5]Yue B, Lu B, Dai KR, et al.BMP2 gene therapy on the repair of bone defects of aged rats.Calcified Tissue Int, 2005, 77(6):395-403.
[6]Lopez MJ, McIntosh KR, Spencer ND, et al.Acceleration of spinal fusion using syngeneic and allogeneic adult adipose derived stem cells in a rat model.J Orthop Res, 2009, 27(3):366-373.
[7]Wang Y, Wang Y, Rui YF, et al.In vitro study on multiple differentiation potential of swine synovium-derived MSCs.Chin J Reparative Reconstr Surg, 2009, 23(6):737-741.(in Chinese)
汪洋, 王友, 芮云峰, 等.猪滑膜源性 MSCs体外多向分化潜能的研究.中国修复重建外科杂志, 2009, 23(6):737-741.
[8]Lim F, Sun AM.Microencapsulated islets as bioartificial endorcrine pancreas.Science, 1980, 210(4472):908-910.
[9]Tobias CA, Han SS, Shumsky JS, et al.Alginate encapsulated BDNF-producing fibroblast grafts permit recovery of function after spinal cord injury in the absence of immune suppression.J Neurotrauma,2005, 22(1):138-156.
[10]Wang X, Wang W, Ma J, et al.Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells in APA microcapsule: A model for studying the interaction between stem cells and their niche.Biotechnol Prog, 2006, 22(3):791-800.
[11]Zhang WJ, Li BG, Zhang C, et al.Biocompatibility and membrane strength of C3H10T1/2 cell-loaded alginate-based microcapsules.Cytotherapy, 2008, 10(1):90-97.
[12]Hernández RM, Orive G, Murua A, et al.Microcapsules and microcarriers for in situ cell delivery.Adv Drug Deliv Rev, 2010,62(7-8):711-730.
[13]Hayashi O, Katsube Y, Hirose M, et al.Comparison of osteogenic ability of rat mesenchymal stem cells from bone marrow, periosteum,and adipose tissue.Calcif Tissue Int, 2008, 82(3):238-247.
[14]Yoshimura H, Muneta T, Nimura A, et al.Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium,periosteum, adipose tissue, and muscle.Cell Tissue Res, 2007,327(3):449-462.
www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):96-100
Observation of viability and BMP-2 secretion of three different microcapsulated adult stem cells transfected with BMP-2 gene
SHEN Yang, ZHANG Shu-hong, TANG Ting-ting
ObjectiveTo test the viability and BMP-2 secretion from microcapsulated BMP-2 gene transfected adult stem cells derived from different tissue.
MethodsThe bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), adipose-derived stem cells (ADSCs), synovium-derived mesenchymal stem cells (SMSCs) from rat tissue were isolated and encapsulated by the alginate-poly-L-lysine-alginate (APA)microcapsules produced by high voltage electrostatic generator.The viability of GFP labeled cells in APA microcapsules were observed by fluorescence microscope at 1 and 4 weeks after encapsulation.Then the BMSCs, ADSCs and SMSCs were infected by the adenovirus containing BMP-2 gene and encapsulated in APA microcapsules.The ELISA method was used to determine the BMP-2 secretion in supernatant of cultured microcapsules.
ResultsThe viability of encapsulated GFP labeled stem cell could be demonstrated by the microscope at 1 and 4 weeks after encapsulation.All encapsulated BMP-2 gene-transfected stem cells were capable of constitutive secrete BMP-2 proteins.BMSCs could secret most BMP-2 proteins which was significant higher than ADSCs or SMSCs at 2, 3 and 4 weeks (P< 0.01) after BMP-2 gene transfection and cells encapsulation.
Conclusion All three kinds of adult stem cells could be used to promote the bone regeneration by the strategy of microcapsule based BMP-2 gene medicine, among which BMSCs is the first choice.
Adult stem cells; Bone morphogenetic proteins; Gene transfer techniques
TANG Ting-ting, Email: tingtingtang@hotmai.com
www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2011, 6(2):96-100
10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.003
国家自然科学基金(30772183);上海教委重点学科建设基金(J50206)
200011 上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科/上海市骨科内植物重点实验室
汤亭亭,Email:tingtingtang@hotmail.com
2011-01-18
Author Affiliations: Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant, Department of Orthopaedic Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine, Shanghai 200011, China
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