愈肠宁胃-结肠分释胶囊对三硝基苯磺酸致大鼠溃疡性结肠炎的影响

谢兴亮，盛艳梅，韩丽，杨明

愈肠宁胃-结肠分释胶囊对三硝基苯磺酸致大鼠溃疡性结肠炎的影响

谢兴亮，盛艳梅，韩丽，杨明

目的评价愈肠宁胃-结肠分释胶囊的药效，并探讨其作用机制。

方法SD 大鼠 48 只，按体重随机分为正常组、对照组、阳性对照组、愈肠宁胃-结肠分释胶囊低剂量组（胶囊低剂量组）、愈肠宁胃-结肠分释胶囊高剂量组（胶囊高剂量组）、愈肠宁溶液组（溶液组），每组 8 只。正常组、对照组均给予同体积生理盐水，阳性对照组给予柳氮磺吡啶肠溶片，其余 3 组分别给予不同剂量的愈肠宁胃-结肠分释胶囊和愈肠宁溶液。各组给药 3 d 后，以三硝基苯磺酸诱导建立大鼠溃疡性结肠炎模型，各组继续给药至 8 d 后结束实验，取大鼠结肠组织测定肠重系数，观察并评价给药后结肠组织损伤指数，同时检测结肠组织髓过氧化物酶（MPO）、TNF-α、IL-1β、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平。结果与正常组比较，对照组大鼠肠重系数、结肠组织损伤指数差异显著，结肠组织 SOD 水平显著降低，MPO、TNF-α、IL-1β、MDA 水平显著升高。与对照组相比，各给药组大鼠肠重系数、结肠组织损伤指数（P＜ 0.05，P＜ 0.01）以及 MPO、TNF-α、IL-1β、MDA 水平均显著降低；胶囊高剂量组、阳性对照组大鼠结肠组织 SOD 水平均显著升高。与溶液组相比，阳性对照组、胶囊高剂量组大鼠肠重系数、结肠组织损伤指数均显著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）；胶囊高剂量组大鼠结肠组织 SOD 水平明显升高，MPO、TNF-α、IL-1β 水平均显著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01），MDA水平则无明显差异。

结论通过抑制炎性细胞浸润和促炎因子的异常释放，以及调节失衡的氧自由基系统等作用机制，愈肠宁胃-结肠分释胶囊表现出与同剂量愈肠宁溶液相比更明显的疗效优势，具有良好应用前景。

结肠炎，溃疡性； 疾病模型，动物； 中草药； 迟效制剂； 胶囊

愈肠宁是治疗溃疡性结肠炎（UC）的中药复方，由黄芪、苦参两味药组成。我们在前期研究中，以其中具有免疫调节、抗炎止泻等作用的药效成分黄芪多糖、黄芪皂苷、苦参生物碱为原料，针对 UC 的病理特征以及药效成分的理化性质、药效特点，设计制备了由黄芪组分胃速释微丸、苦参组分结肠靶向释药微丸组成的愈肠宁胃-结肠分释胶囊[1]。在此基础上，为进一步评价该制剂设计制备的科学性、合理性，本研究我们选择了三硝基苯磺酸（TNBS）诱导大鼠 UC 模型对其药效进行评价，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 愈肠宁胃-结肠分释胶囊为成都中医药大学药学院中药药剂教研室自制；苦参碱（M-071201）、氧化苦参碱（O-071201）、黄芪多糖提取物（20081012）均购自西安中鑫生物技术有限公司；黄芪皂苷提取物（XC080228）购自西安小草植物科技有限公司；柳氮磺吡啶肠溶片（SASP）为上海信谊嘉华药业有限公司生产，批号：081103；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）为美国 Sigma公司生产，批号：107K5008；TNF-a ELSIA 试剂盒（RT110371）购自北京博奥森生物技术有限公司；IL-1β ELSIA试剂盒（20090110）购自武汉博士德生物工程有限公司；髓过氧化物酶（MPO）试剂盒（20090204）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（20090204）、丙二醛（MDA）试剂盒（20090204）、考马斯亮蓝试剂盒（20090204）均购自南京建成生物工程研究所。Model 550 酶标仪为美国 BIORAD 公司产品；UV1700 紫外分光光度计为日本岛津公司产品；DY89-I 型匀浆机为宁波新芝生物科技股份有限公司产品；TG2-16C 型离心机为上海安亭科学仪器厂产品。

1.1.2 实验动物 健康 SD 大鼠两批共 48 只，雌性，7 ～ 8 周龄，体重 200 ～ 250 g，由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（川）2008-11，饲养于清洁级动物房。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 待大鼠适应 1 周饲养后，按体重随机分成 6 组：正常组、对照组（造模大鼠）、阳性对照组、愈肠宁胃-结肠分释胶囊低剂量组（胶囊低剂量组）、愈肠宁胃-结肠分释胶囊高剂量组（胶囊高剂量组）、愈肠宁溶液组（溶液组），每组 8 只。

1.2.2 给药方案 ①阳性对照组：取柳氮磺吡啶肠溶片，研细、过筛，配制成浓度为 30 mg/ml 的混悬液，以 0.6 g/kg 的剂量灌胃给药；②胶囊低剂量组：以 7.3 mg/kg 的剂量，胃插管（内径 2.0 mm、外径 3.0 mm）给予分释胶囊中包衣微丸；③胶囊高剂量组：以 14.5 mg/kg 的剂量，胃插管（内径2.0 mm、外径 3.0 mm）给予分释胶囊中包衣微丸；④愈肠宁溶液按 7.8∶2.6∶1∶3 比例取黄芪多糖、黄芪皂苷、苦参碱、氧化苦参碱，配制成浓度为14.5 mg/ml 的混合溶液，以 0.29 g/kg 的剂量灌胃给药（与胶囊高剂量组药物量相同）。正常组和对照组均灌胃给予同体积的生理盐水，各组均每日1 次给药。

1.2.3 TNBS 诱导大鼠 UC 模型的建立 各组大鼠经给药 3 d 后，第 4 天禁食不禁水 24 h，进行乙醚吸入麻醉后，参照文献[2]方法进行造模。取 5%（w/v）TNBS 水溶液，加入乙醇配制成浓度为 20 mg/ml 的 50% TNBS 乙醇溶液。经各组大鼠肛门轻缓插入灌胃针 8 cm，按 64 mg/(kg·d) 剂量缓慢注入相应体重比例的 TNBS 乙醇溶液，倒提 30 s，正常组大鼠灌肠给予相应体积生理盐水，使动物保持平躺，自然清醒。第 5 天起各组大鼠继续给药 8 d。1.2.4 实验考察指标 实验期间观察动物便血、腹泻、饮食及活动情况。实验完成后，处死大鼠，取结肠，纵剖开后用冰生理盐水洗净粪便，滤纸吸干水分、称量，计算肠重系数：结肠重/体重 × 100%。然后取小段结肠用 10% 甲醛固定，酒精脱水，石蜡包埋，切片后行 HE 染色，光镜下观察结肠病理变化，并参照文献[2]中标准，采用双盲法分项计分，最后将各项分数相加计算总分作为结肠组织损伤指数，以评价结肠的损伤程度（表 1）。另取炎症改变较明显的结肠，洗净后制成匀浆，530 ×g离心 15 min，取上清液分装，-20 ℃ 保存，分别按各试剂盒说明书检测 TNF-α、IL-1β、MPO、SOD、MDA 水平及总蛋白含量，并以总蛋白含量对前述各指标数据进行校正。

1.3 统计学处理

应用 SPSS 13.0 统计学软件进行数据处理，首先对各组数据进行正态检验（normality plots with tests），方差齐时采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差不齐时采用非参数检验（nonparametric tests）。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠结肠肠重系数及组织学损伤的影响

与正常组比较，对照组大鼠肠重系数明显增加，结肠组织损伤指数差异显著，溃疡面积大、病变深、炎症明显、伴有纤维化和肉芽组织。与对照组相比，各给药组大鼠肠重系数、结肠组织损伤指数均显著降低，表现出明显的抗 TNBS 损伤作用。与溶液组相比，阳性对照组、胶囊高剂量组大鼠肠重系数、结肠组织损伤指数均显著降低，表现出更好的抗结肠炎性损伤和增生的作用（表 2，图 1）。

2.2 大鼠结肠组织 SOD、MDA 水平

与正常组比较，对照组大鼠结肠组织 SOD 水平显著降低，MDA 水平显著升高，表明结肠组织自由基处于失衡状态。与对照组相比，胶囊高剂量组、阳性对照组大鼠结肠组织 SOD 水平均显著升高，MDA 水平显著降低。与溶液组相比，胶囊高剂量组大鼠结肠组织 SOD 水平升高的更为明显，而 MDA 水平则无显著差异（表 2）。

表1 大鼠结肠病理损伤程度评分标准[2]Table 1 The score standard for the degree of colon pathological injury of rats

表 2 各组大鼠结肠组织损伤情况及 SOD、MDA 水平（x± s ，n = 8）Table 2 The level of SOD , MDA and colon tissue injury of rats in different groups (x± s , n = 8)

表 3 各组大鼠结肠组织 MPO、TNF-α、IL-1β 水平（x± s ，n = 8）Table 3 The level of MPO, TNF-α and IL-1β of rats in different groups (x± s , n = 8)

图 1 大鼠结肠组织损伤的组织学观察 HE × 100（A：正常结肠组织；B：结肠组织浆膜层炎症；C：结肠组织溃疡；D：结肠坏死组织；E：结肠肉芽组织；F：结肠组织纤维化）Figure 1 Histological observation of colon tissue injury of rats HE × 100.A: Normal colon tissue; B: Inflammation of placenta percreta in colon tissue; C: Ulcer of colon tissue; D: Necrotic tissue of colon; E: Granulation tissue of colon; F: Fibrosis of colon tissue.

2.3 大鼠结肠组织 MPO、TNF-α、IL-1β 水平

与正常组比较，对照组大鼠结肠组织 MPO、TNF-α、IL-1β 水平均显著升高，中性粒细胞浸润明显，促炎因子分泌十分活跃。与对照组相比，各给药组大鼠结肠组织 MPO、TNF-α、IL-1β 水平均显著降低，显示出良好的抗中性粒细胞浸润和促炎因子释放的作用。与溶液组相比，胶囊高剂量组大鼠结肠组织 MPO、TNF-α、IL-1β 水平均显著降低，显示出更强的下调炎性反应作用（表 3）。

3 讨论

目前，UC 的特异性病因尚不明确，但结肠炎性反应导致的组织损伤是其病理学关键[3]。临床研究发现，UC 患者活动期结肠黏膜组织 MPO、TNF-α、IL-1β、MDA 水平均明显升高，SOD 水平显著下降，其中 TNF-α、IL-1β 是公认的能介导 UC急性炎症损伤的重要因子，其含量与病变程度呈正相关[3]。MPO 是反映中性粒细胞浸润程度的特征性指标，UC 发作时大量中性粒细胞在结肠黏膜聚集，释放炎性介质参与炎症反应。TNBS 诱导大鼠UC 模型能很好地体现上述指标变化，与人体 UC病理反应相似，较适合于药物药效和作用机制的研究[4]。本实验结果表明，愈肠宁胃-结肠分释胶囊能显著对抗 TNBS 导致的大鼠结肠组织病理损伤，其作用机制主要表现为对抗结肠局部 TNF-α、IL-1β 等促炎因子分泌和中性粒细胞浸润，以及调节失衡的自由基系统。

制剂释药行为是影响其疗效的关键因素之一，特别是化学组成复杂的中药复方制剂。我们的课题研究根据：①临床治疗 UC 时，黄芪多采用煎汤、入丸散口服，苦参多以煎汤灌肠；②黄芪中皂苷、多糖主要在小肠吸收后发挥免疫调节作用，但其黏性较大，水溶性不佳而影响其溶出度；③苦参生物碱抗炎止泻作用强度与其在效应室的浓度直接相关，但其口服吸收后在结肠分布有限等认识，将黄芪多糖、皂苷制成胃部速释微丸以改善其溶出性能，苦参生物碱制成结肠靶向微丸以提高其在结肠的药物浓度，再将两者组合成具有两步释药特征的现代中药复方释药系统——愈肠宁胃-结肠分释胶囊，以充分发挥复方中各种成分的综合作用，但其实际疗效如何，还需要进行客观评估。在本研究中，与同剂量愈肠宁溶液相比，该胶囊显示出明显的疗效优势，表明研究拟定的愈肠宁胃-结肠分释胶囊制剂设计、制备方案基本达到了以制剂增效的设计目标。此次研究结果提示，我们在前期课题研究中提出的将多元释药技术用于中药复方以制备现代中药复方释药系统[5]这一新思路具有良好应用前景，值得继续深入研究。

[1]Xie XL.The study of drug delivery system of YuChangning.Chengdu:Chengdu University of TCM, 2009:42-68.(in Chinese)

谢兴亮.愈肠宁复方释药制剂的研究.成都: 成都中医药大学，2009:42-68.

[2]Chen YQ, Dong FL, Ma GT.Experimental study of ulcerative colitis in rats incluced by trinitrobenzene sulfonic acid.J Tongji Univ (Med Sci), 2006, 27(6):31-33.(in Chinese)

陈英群, 董福轮, 马贵同.三硝基苯磺酸诱导大鼠溃疡性结肠炎的实验研究.同济大学学报(医学版), 2006, 27(6):31-33.

[3]Jiang XL.Ulcerative colonitis.Beijing: China Medical Science Press,2005:38-43, 490-509.(in Chinese)

江学良.溃疡性结肠炎.北京: 中国医药科技出版社, 2005:38-43,490-509.

[4]Sheng YM, Xie XL, Yang M, et al.A study on components of Yuchangning as A new herbal recipe.Herald Med, 2008, 27(3):258-261.( in Chinese)

盛艳梅, 谢兴亮, 杨明, 等.中药新复方愈肠宁的组方研究.医药导报, 2008, 27(3):258-261.

[5]Yang M, Feng Y, Xu DS, et al.Technical lines for advanced tcm drug release system.Mod Traditional Chin Med Materia Materia-World Sci Technol, 2006, 8(5):10-15.(in Chinese)

杨明, 冯怡, 徐德生, 等.现代中药复方释药系统的构建.世界科学技术-中医药现代化, 2006, 8(5):10-15.

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):111-115

Effect of Yuchangning capsule releasing drug respectively in stomach and colon on ulcerative colitis in rats caused by TNBS

XIE Xing-liang, SHENG Yan-mei, HAN Li, YANG Ming

ObjectiveTo evaluate the pharmacodynamic action of Yuchangning capsule releasing drug respectively in stomach and colon, and explore the mechanism of action.

MethodsThe forty-eight SD rats were randomly individed into normal group, control group, positive control group, the low dose of capsule group, the high dose of capsule group and liquor group with eight rats in each group.The rats in the normal and control groups were perfused with the same volume physiological saline, the rats in the positive control group were perfused with sulfasalazine, and the rats in the other three groups were perfused with the different doses of Yuchangning capsule releasing drug respectively in stomach and colon and Yuchangning liquor.3 days after the perfusion, the trinitro-benzene-sulfonic acid was perfused into the rats in order to establish the rat model of ulcerative colitis, and the experiment was finished on the 8th day after continuous perfusion.The colon tissue of rats were taken to determine the coefficient of colon weight, observe and evaluate the exponent of colon injury, and detect the level of MPO, TNF-α, IL-1β, SOD and MDA in colon tissue.

ResultsCompared with the normal group, the coefficient of colon weight and exponent of colon injury showed remarkable differences, the level of SOD in colon tissue remarkably decreased, and the level of MPO, TNF-α, IL-1β, MDA remarkably increased in the control group.Compared with the control group, the coefficient of colon weight, exponent of colon injury (P＜ 0.05,P＜ 0.01)and the level of MPO, TNF-α, IL-1β and MDA all remarkably decreased in the other groups, the level of SOD remarkably increased in the high dose of capsule group and positive control group.Compared with the liquor group, the coefficient of colon weight and exponent of colon injury both remarkably decreased (P＜ 0.05,P＜ 0.01) in the hige dose of capsule group and positive control group;At the same time, the level of SOD remarkably increased, and the level of MPO, TNF-α, IL-1β all remarkably decreased (P＜ 0.05,P＜ 0.01).There was no significant difference in the level of MDA between the high dose of capsule group and the liquer group.

Conclusion Through the mechanism of inhibiting the infiltration of inflammatory cells and the abnormal release of proinflammatory factors, and adjusting the disequilibrium of oxygen-derived free radicals, the Yuchangning capsule releasing drug respectively in stomach and colon showed better curative effect than the same dose of Yuchangning liquor, and possessed fine application prospects.

Colitis, ulcerative; Disease models, animal; Drug, Chinese hebal; Delayed-action preparations; Capsules

YANG Ming, Email: yangming16@126.com

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2011, 6(2):111-115

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.006

国家“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09103-307）

610083 成都医学院药学院药剂教研室（谢兴亮），药理教研室（盛艳梅）；611173 成都中医药大学药学院药剂教研室（韩丽）；330004南昌，江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室（杨明）

杨明，Email：yangming16@126.com

2011-01-24

Author Affiliations: Department of Pharmacy (XIE Xing-liang), Department of Pharmacology (SHENG Yan-mei), Pharmaceutical College, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China; Department of pharmacy, Pharmaceutical College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611173, China (HAN Li); Key Lab of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China (YANG Ming)

·综述·