PI3K/Akt信号通路与肝纤维化

黄 成，李 俊，马陶陶

(安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032)

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝脏对各种慢性刺激进行损伤修复反应时，以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内大量沉积的病理过程。关于HF机制及其防治的研究近年来己成为国内外生物学、医学研究的热点课题之一。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纤维化形成过程中居核心地位，它激活、增殖，并合成、分泌细胞外基质等多种物质，使ECM合成与降解失衡，在肝脏内过度沉积，肝脏结构改变，导致肝纤维化［1］。磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)家族，是一类特异性地催化磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)3位羟基磷酸化，并产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶，可以募集和激活下游的靶物质而启动一系列信号联级反应。PI3K普遍存在于体内各类细胞，在细胞存活与分化、细胞生长、运动和凋亡等多种生理和病理过程中起重要作用［2］，参与自身免疫性疾病、神经系统疾病以及肿瘤等多种疾病的发生发展［3－5］。大量文献表明PI3K信号通路与肝纤维化的形成密切相关［6］，现就PI3K/Akt信号通路及其在肝纤维化中的作用作一综述。

1 PI3K/Akt信号通路的组成

1.1 PI3K的组成PI3K是Whitman等［7］发现的一种与细胞内信号转导有关的脂类第二信使，与v-src和v-ras等原癌基因的产物相关。哺乳动物细胞中PI3K是由调节亚基p85和催化亚基p110所组成的异二聚体，具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的双重活性。依结构和底物的特异性不同，PI3K为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型;能被细胞表面受体激活的Ⅰ型PI3K研究最多;Ⅰ型PI3K依p110结合亚基的不同又分为IA和IB两种亚型;IA型PI3K催化亚基p110包括p110α，p110β，p110δ;调节亚基主要有 p85α，p85β，p85γ;IB型PI3K催化亚基主要为 p110γ［8］;调节亚基包含:1个SH3区域、2个富含脯氨酸的区域、2个被一非编码区分开的Src同源结构域(Src homology domain 2，SH2)，该非编码区为p85和p110相互作用的区域，2个SH2结构域可与磷酸化的酪氨酸残基结合，引起催化亚基的膜转位和活化，传导酪氨酸激酶信号。Ⅰ型PI3K在体内最常见底物为磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸［PtdIns(4，5)P2，简称 PIP2］［9］。

1.2 Akt的组成Akt(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog)又称蛋白激酶B(PKB)，是原癌基因c-akt编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。目前发现Akt有3种亚型:Akt1和Akt2在人体各组织中普遍表达，Akt3表达则有组织特异性［10］。3者受不同的基因编码调节，蛋白结构有将近80%的同源性，由位于氨基端的PH结构域、中间催化域和羧基端的调节域结构域组成。PH结构域介导脂质与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间的相互作用;中间催化域具有催化丝/苏氨酸残基磷酸化活性;羧基端的调节域含有磷酸化位点Ser473，该位点的磷酸化是Akt完全活化所必需的［11］。

2 PI3K/Akt信号通路的活化

PI3K/Akt通路的激活是一个多步骤的过程，包括两种方式，一种是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起二聚体构象改变而被激活;另一种是通过Ras和p110直接结合导致PI3K活化［12］。当细胞外的配体与相应的受体结合后，受体被激活发生同源或异源寡聚化或者RTK(receptor tyrosine kinase，受体酪氨酸激酶)自身磷酸化，为p85调节亚单位的SH2结构域提供锚定位点，激活p85;改变p110和p85复合体的构象，解除p85对p110激酶的抑制，活化p110，催化膜表面的 PIP2，生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸［PtdIns(3，4，5)P3，简称PIP3］。PIP3作为第二信使与Akt的PH结构域结合，使其从胞质转位至细胞膜，定位于PDK1(phosphoinositide dependen tkinase 1，磷酸肌醇依赖性激酶1)和PDK2附近。Akt的构象发生变化，暴露其磷酸化位点，PDK1磷酸化Akt的Thr308，PDK2磷酸化Ser473;活化的Akt脱离质膜进入胞质和胞核，引起信号转导通路的级联反应，从而调节细胞的生存、增殖、分化、凋亡等重要的生物学事件［13］。

3 PI3K/Akt信号通路的调节

PI3K/Akt信号通路受到很多因素的影响。磷酸酯酶PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)通过使 PI(3，4，5)P3 在3羧基位脱磷酸生成PI(4，5)P2拮抗PI3K的活性。SHIP1/2(SH2 domain containing inositol 5`-phosphatase)基因，通过使PI(3，4，5)P3 在5 位去磷酸化，生成 PI(3，4)P2，减少 Akt的活化［14］。抑癌基因PHLPP1/2(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase)包括PHLPP1和 PHLPP2，可减弱Akt疏水基团的磷酸化水平，抑制细胞周期G1期向S期的转化［15］。最近研究人员利用Akt羧基末端调节结构域为探针，发现一种抑制Akt的磷酸化的负性调节因子——羧基末端调节蛋白(CTMP)，可阻断Akt下游信号的传递。

4 PI3K/Akt信号通路与肝纤维化关系

肝纤维化是慢性损伤导致肝脏细胞外基质(ECM)过度沉积，肝星状细胞(HSC)是肝纤维化的主要效应细胞。在各种因素作用下，肝细胞、Kupffer细胞、内皮细胞和星状细胞自身可产生多种细胞因子与活化产物等，这些因子可以通过各种信号通路调节HSC的功能，PI3K/Akt是其中重要的一条通路［16］。

4.1 PI3K/Akt信号通路和肝脏ECM的关系细胞外基质特别是胶原的过度沉积，是肝纤维化形成的病理基础。研究表明，PI3K/Akt信号通路在肝脏ECM产生和降解中起到重要作用。Reif等［17］应用PDGF刺激HSC发现，Akt的磷酸化水平、α1(Ⅰ)mRNA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平均升高;其后应用 PI3K抑制剂 LY294002或 Akt显性失活突变体Ad5dnAkt发现，α1(Ⅰ)mRNA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平均明显减少;进一步研究发现转基因小鼠pCol9GFP-HS4，5分离的HSC，应用 LY294002可抑制报告基因的活性，表明PI3K在转录水平调节胶原蛋白的表达。而利用Ad-SMAdn-PI3K转染活化的HSC，通过荧光显微镜观察可发现阻断PI3K活性能够减少α1(Ⅰ)胶原的表达［18］。上述研究表明PI3K/Akt信号通路活性与胶原的生成具有明显的相关性。

肝纤维化的产生是肝脏ECM的合成和降解失衡的过程，与肝脏ECM降解相关的主要是基质金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)。MMP具有降解胶原等ECM的作用，而TIMP可抑制MMP的作用。PI3K/Akt信号通路与MMP、TIMP的表达亦有关系。应用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶作用于HSC，可使MMP-2与TIMP-2表达增高，利用PI3K抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)或雷伯霉素(rapamycin，p70S6K抑制剂)则降低两者的表达［19］。Li等［20］应用leptin刺激HSC，发现TIMP-1表达增高与PI3K/Akt的活性有关。Lechuga等［21］也报道 LY294002能明显抑制 TGFβ1对MMP-13的mRNA和蛋白诱导作用。这些实验结果提示，活化PI3K/Akt在不同的细胞微环境中对MMP分泌的调节不同，对TIMP的调节则主要表现为增加分泌。由此给我们新的启示:PI3K/Akt信号通路可影响MMP和TIMP的平衡，通过干预PI3K/Akt信号通路恢复MMP和TIMP的平衡可成为抗肝纤维化的一个靶点。

4.2PI3K/Akt信号通路与HSC的关系肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化形成的中心环节，研究HSC增殖、凋亡的机制对了解肝纤维化的形成具有重要意义。近年来的多项研究表明，PI3K/Akt通路在HSC增殖、凋亡中扮演重要角色。Sancho-Bru等［22］将HSC与Huh7细胞共培养，发现Huh7细胞主要通过PI3K/Akt通路的活化促进HSC的增值。利用Ad-SMAdnPI3K转染HSC，培养72 h后可发现细胞数量减少;进一步研究表明Ad-SMAdnPI3K转染的HSC与对照组比较，细胞周期蛋白D1表达明显降低［18］。而利用高半胱氨酸(0.5 mmol·L－1)处理 HSC，48 h后采用［3H］-thymidine参入法检测，DNA合成率可提高73%，7 d后检测细胞数提高51%，应用渥曼青霉素处理后，则明显抑制HSC的增值［23］。TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员之一，因能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常组织细胞几乎无毒性，受到广泛的关注。利用TRAIL处理LX-2人肝星状细胞系，可使细胞凋亡比率明显增加，同时Akt磷酸化水平亦降低［24］。Panner等［25］在研究多形性恶性胶质瘤发现，PI3K/Akt信号通路可通过活化mTOR(Mammalian target of rapamycin，一种与PI3K/Akt通路相关的蛋白激酶)激活p70S6K(核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶，通过磷酸化S6K，增强mRNA的翻译)，促进FLIP(c-FLICE inhibitory protein)的蛋白表达，FLIP通过抑制caspase-8的活性，而抑制TRAIL引起的细胞凋亡。我们近期研究亦发现，肝纤维化形成过程中c-FLIPL表达明显增加，通过siRNA干扰抑制c-FLIPL可明显增加HSC对TRAIL诱导凋亡的敏感性，进一步研究发现，PI3K/Akt信号通路调控c-FLIPL的表达;上述实验结果表明PI3K/Akt信号通路在促进细胞增殖的同时，亦通过调控c-FLIPL抑制细胞凋亡。应用促HSC凋亡的药物联合PI3K/Akt抑制剂，将有效的抑制HSC增殖，促进HSC的凋亡，减少ECM的分泌，这给我们治疗肝纤维化提供了新的思路。

4.3PI3K/Akt与致纤维化因子在肝纤维化病程中，一系列细胞因子通过旁分泌和自分泌方式作用于HSC，影响其活化、增殖与凋亡，调控着肝纤维化的发生、发展［26］。

转化生长因子(transforming growth facor beta，TGF-β)是刺激HSC分泌ECM作用最强的细胞因子之一。TGF-β由Kupffer细胞、内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞和HSC等多种细胞所分泌，Smad信号蛋白通路是TGF-β经典的信号转导通路［27］。利用 TGF-β1作用于 LY294002预处理后的人HSC，TGF-β1 依赖性的 ADAM12(融合素-α，参与肌母细胞融合和肌管形成)表达减少，p70S6K磷酸化水平亦明显降低［28］。Neef等［29］，在应用 BDL 和 TAA 建立大鼠肝纤维化模型过程中，分别与28 d，42 d后给予大鼠口服雷帕霉素(0.5 mg·kg－1·d－1)14 d，结果发现与未用雷帕霉素相比，TAA组大鼠 TGF-β1 mRNA水平降低 50%，BDL组大鼠TGF-β2 mRNA水平亦降低50%。Runyan等［30］在研究TGF-β作用于肾小球系膜细胞时亦发现，LY294002或Akt显性失活突变体可减少TGF-β诱导的α1(Ⅰ)、α2(Ⅰ)胶原的表达。进一步研究发现，TGF-β诱导的PI3K/Akt活化可磷酸化Smad3的丝氨酸位点，从而增强Smad3的转录活性，来增强Ⅰ型胶原的表达。说明PI3K/Akt的活化具有促进TGF-β表达，增强其活性的功能。

血小板源性生长因子(PDGF)是强大的促细胞分裂剂，是体内主要的促纤维化因子，现已发现4种亚型，且在HSC均有表达［31］;PDGFβ受体表达增加是HSC活化的一个标志，PDGFβ受体合成与PI3K/Akt通路有关，应用PI3K通路抑制剂渥曼青霉素和LY294002可阻断PDGFβ受体的表达［32］;Wang等［33］研究了索拉非尼(靶向抑制 PDGF 受体)抗纤维化作用，发现索拉非尼可通过抑制Akt、p70S6K磷酸化，抑制HSC的增殖，降低胶原的合成。Chen等［34］利用绞股蓝总苷处理PDGF诱导的HSC，研究发现，绞股蓝总甙通过抑制PDGF-PI3K/Akt-p70 S6K信号途径抑制PDGF诱导的HSC增殖活化。以上实验结果表明，PI3K/Akt信号通路在PDGF受体的表达，信号的传导中具有重要作用。

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)是一类重要的促细胞活化、分裂的生长因子，在促进HSC增殖、分化等方面起了重要的作用。研究证实LY294002和雷帕霉素抑制IGF-Ⅰ诱导的鼠HSC中DNA合成;利用丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)抑制剂PD98059对IGF-Ⅰ诱导的DNA合成抑制作用较弱;说明PI3K信号传导途径，在IGF-Ⅰ诱导HSC的DNA合成中起着重要作用［35］。Gentilini等［36］利用渥曼青霉素和 LY294002抑制IGF-Ⅰ诱导的 HSC分化，影响其 DNA合成，揭示了IGF-Ⅰ能通过PI3K信号传导途径，影响HSC迁移及促有丝分裂，激活HSC的增殖。

瘦素(leptin)在肝纤维化形成过程中也发挥了重要的作用［37］。Aleffi等［38］应用 leptin 处理人 HSC，结果表明 MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1)，VEGF(vascular endothelial growth factor)，Ang-1(angiopoietin-1)等促炎症反应和促纤维化因子表达明显增高，并增强PI3K/Akt通路的活性。我们前期应用 leptin(75 μg·L－1)处理原代培养的大鼠HSC，Western blot和EMSA分析显示Ⅰ型胶原明显增高，采用［3H］-thymidine参入法研究了leptin对HSC增值效应，结果显示增值率达正常值的3倍，并明显促进Cyclin D1表达;而应用LY294002或A771726(来福米特活性代谢物)预培养后HSC增值效应，Cyclin D1及Ⅰ型胶原的表达明显受到抑制［39］。PI3K/Akt对促肝纤维化因子的调控作用，显示了PI3K/Akt通路在肝纤维化形成中的重要地位。

细胞信号通路是个复杂的网络，PI3K/Akt信号通路与其他信号通路之间存在密切的联系，对肝纤维化的形成也具有重要作用。如IGF-1和PDGF可同时增加HSC中PI3K和ERK通路的活性，而PI3K还参与ERK通路的激活。信号通路的协同作用对肝纤维化进程中维持HSC的活化状态具有重要作用。有报道［32］，在人HSC的培养中，应用PI3K的抑制剂可使Ras/ERK通路的活性下降40% ～50%，表明PI3K参与Ras/ERK通路的活化。

5 展望

肝纤维化的形成是一个复杂的过程，涉及多条信号通路、多种细胞和细胞因子。PI3K/Akt信号通路从多个方面参与肝纤维化的形成。细胞因子间在体内如何协调，各条通路间的相互作用及PI3K/Akt通路所起的作用还有待进一步研究;不同因素造成的肝纤维化模型中及肝纤维化形成的不同阶段，PI3K/Akt通路所起作用的差别也有待进一步明确。抗肝纤维化药物的研发是目前的热点，PI3K/Akt通路是由多种物质序贯而成，许多物质与其他通路间又存在交叉联系，因此在研究药物对其作用时，既要把握重点，又要有整体观念。

总之，PI3K/Akt信号通路在肝纤维化发病机制中发挥着重要作用，随着对它认识的逐步深入，对于阐明肝纤维化的发病机制，寻找治疗肝纤维化的方法有着积极的意义。

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