肝纤维化中星状细胞促血管生成分子机制的研究

张 峰，魏东华，孔德松，张晓平，陆 茵，3，王爱云，3，陈文星，3，郑仕中，3

(1.南京中医药大学药学院，江苏南京 210029;2.哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江大庆 163319;3.南京中医药大学，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210046)

肝纤维化(hepatic fibrosis)是继发于各种形式慢性肝损伤之后的组织修复反应，若无有效治疗将演变为肝硬化和肝癌。肝纤维化病理过程中，肝内细胞间以及细胞与基质间发生复杂的相互作用，结缔组织异常增生，引起肝小叶和肝脏血流的病理性改变以及假小叶和结节形成，破坏肝脏实质与功能［1］。

现已明确，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化并转变为肌成纤维细胞(myofibroblast，MF)是肝纤维化发生的中心环节［2］。HSC是肝脏特有的周细胞，位于肝血窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cell，SEC)与肝细胞之间的Disse间隙内，对肝脏微血管的结构与功能具有重要调节作用［3］。近年来，随着对肝纤维化病理机制研究的不断深入，发现肝纤维化进程与病理性血管生成之间关系密切，特别是活化型HSC可表达多种促血管生成因子旁分泌作用于SEC使其发生增殖与迁移，从而促进血管新生并加速肝纤维化进程。阐明HSC促进肝纤维化病理性血管生成的分子机制已受到越来越多的关注，从中有可能发现抗肝纤维化治疗的新靶标。

1 肝纤维化进程中的病理性血管生成

血管生成(angiogenesis)是指经多种因子的作用，在原有血管结构的基础上生长出新毛细血管的生物学过程，缺氧是血管生成的主要刺激因素。肝纤维化中细胞外基质过度沉积使得肝小叶下静脉、小叶中央静脉及肝静脉窦受压，导致肝静脉压力和门静脉血管阻力均增高。当门静脉阻力的增加超出机体代偿能力时，门静脉血流速度及血流量降低，肝脏血氧供应减少从而形成缺氧［4］。Rosmorduc等［5］利用胆道结扎致大鼠肝纤维化模型首次报道了肝纤维化与血管生成之间的关联。此后诸多研究者利用二乙基亚硝胺、CCl4以及胆碱缺乏的氨基酸饲料喂养等因素所致鼠类肝纤维化模型进行体内、外的实验研究，均发现纤维化致缺氧条件下的病理性血管新生现象十分明显，肝组织内多种促血管生成因子表达明显增加［6-8］。

然而肝纤维化区域的新生血管紊乱，多数为未成熟的无效血管，并不能改善局部的组织缺氧状态;此外，血管新生导致再生肝细胞周围形成血管丛和分流，阻碍血窦和肝细胞间的物质交换，再生肝细胞不能建立正常的门脉分支，进而加剧肝细胞损伤［9］。因此，肝纤维化与血管新生之间形成恶性循环，血管生成增加而纤维化不退反进，严重阻碍了肝纤维化的逆转与恢复。

2 肝星状细胞表达的促血管生成关键因子

2.1缺氧诱导因子缺氧诱导因子(HIF-1α)是一种受细胞内氧浓度调节的转录因子。缺氧条件下，HIF-1α稳定性增加并迅速活化，转移到细胞核内与目的基因启动子或增强子上的缺氧反应元件(HRE)结合从而激活转录过程［10］。目前已明确HIF-1α可直接激活多种促进血管生成因子的基因表达。

2.2血管内皮生长因子血管内皮生长因子(VEGF)是HIF-1α激活的一个主要的促血管生成因子。VEGF可诱导基质金属蛋白酶的表达，降解毛细血管基底膜从而有利于内皮细胞的迁移和趋化;VEGF通过与其受体VEGFR-2结合，以蛋白激酶C途径(不依赖于Ras)激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路促进内皮细胞增殖［11］。VEGF是肝脏病理性血管生成的重要启动因子之一，在与血管外基质降解和SEC形态学改变相关的血管生成早期阶段发挥关键作用。

2.3Notch受体Notch受体(Notch1-4)和Notch配体(Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3 和 Delta4)是跨膜受体蛋白家族成员，与其胞内效应分子共同组成Notch信号转导通路，对血管发生发展的多个环节有重要调控功能。Notch受体通过与其配体结合启动Notch信号转导，不需第二信使和蛋白激酶的参与就可直接将邻近细胞信号转导至核内，进而激活相关转录因子。目前已发现，肝脏中各种类型的细胞均能表达Notch 受体与相关因子［12］。

2.4血小板衍生生长因子血小板衍生生长因子(PDGF)由二硫键连接的同源二聚体或异源二聚体组成，其受体(PDGF-βR)属受体酪氨酸激酶家族。PDGF受体结合配体后，胞内结构域酪氨酸残基自身磷酸化将信号传入胞内，进而激活下游级联反应。PDGF是一有效的血管生成趋化因子，对周细胞募集有促进作用。在肝脏血管生成中，SEC分泌的PDGF能够诱导并募集表达其受体的HSC至新生血管周围，使其稳定成熟从而转变为具有正常功能的血管［13］。

2.5促红细胞生成素产生肝细胞受体促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph受体)及其配体Ephrin均是细胞膜上的受体酪氨酸激酶，根据序列保守性和它们的亲和力不同均分为A、B两个亚类。现已发现9种EphA受体(EphA1-A9)、6种EphrinA配体(EphrinA1-A6)、6种EphB受体(EphB1-B6)和3种EphrinB配体(EphrinB1-B3)。Eph受体与Ephrin配体均可发生磷酸化从而介导双向信号转导过程，即配体也具有受体样功能，接受受体刺激后产生反向信号传递调节细胞反应［14］。肝纤维化中，Ephrin配体与Eph受体是HSC促进血管生成以及与SEC进行信号交流的重要调控因子。

2.6瘦素瘦素(leptin)是Ob基因的编码产物，主要通过与细胞表面的功能性受体ObRb结合，经Janus激酶-信号转导及转录激活因子(JAK-STAT)途径发挥生物学作用。瘦素结合ObRb后引起JAK1、JAK2及受体胞质区磷酸化，进而下游蛋白STAT磷酸化并转至核内调控相应基因的表达;瘦素还可通过ERK1/2和PI3K依赖性的机制稳定HIF-1α，促进其转移至核内从而启动缺氧诱导的血管生成过程［15］。

2.7Hedgehog蛋白Hedgehog蛋白(Hh)为疏水性分泌型蛋白，其介导的信号通路主要由Hh配体、跨膜受体Ptch和Smo及下游转录因子Gli级联构成。当Hh配体缺失时，Ptch抑制Smo的活性，Hh通路处于失活状态;当Hh配体存在时，与Ptch结合从而解除对Smo的抑制，Gli继而从微管解离并转入核内诱导目标基因的转录;胞内Gli的表达水平可反映Hh通路的活化状态。Hh通路可通过Rho激酶依赖性机制促进血管腔形成;还可经iNOS/Netrin/PKC途径上调VEGF 的表达［16］。

2.8血管生成素-1血管生成素(angiopoietin，Ang)-1是另一特异性作用于内皮细胞的调节因子。血管周细胞分泌的Ang-1与其内皮细胞上的Tie-2受体特异性结合后促使其磷酸化，通过下游Akt/Survinin信号转导途径抑制内皮细胞凋亡及通过PI3K/FAK转导途径募集周细胞至新生血管壁，促进血管成熟与稳定;Ang-1也是内皮生存因子，可以抑制VEGF以及炎症因子引起的血浆渗漏［17］。

3 肝星状细胞促进血管生成的信号转导途径

3.1VEGF-Notch信号途径Ankoma-Sey等［18］利用 CCl4致大鼠肝纤维化模型首次证实了活化的HSC能时间依赖性地高表达VEGF，并伴有其受体VEGFR-1和VEGFR-2的表达上调;平行进行的体外实验也发现，原代培养的大鼠HSC在活化过程中VEGF表达逐渐升高。缺氧还可诱导大鼠HSC表达环氧合酶(COX)-2，进而激活HIF-1α，增强VEGF的转录并促进其释放［19］。在d-半乳糖胺和脂多糖致小鼠肝损伤中，VEGFR-2通路的激活可抑制化学物质对SEC的细胞毒作用并减少其凋亡，在肝损伤血管生成中可能起主要作用［20］;给CCl4致肝纤维化小鼠单独或联合服用VEGFR-1和VEGFR-2抗体可明显抑制肝脏血管生成并减轻纤维化病变程度，并且VEGFR-2抗体要比 VEGFR-1抗体更有效［7］，这进一步表明在肝纤维化血管生成中VEGF与VEGFR-2的相互作用是主要的。人HSC在缺氧应答时VEGF受体表达情况与大鼠不同，人HSC中VEGF的两个主要受体VEGFR-1和2均上调，而在大鼠HSC中主要是VEGFR-1上调［21］。此外，缺氧时VEGF可诱导HSC表达Notch配体Dll4，与SEC膜上相应Notch受体结合后促使其作出血管生成应答［22］。在病理状态下，SEC内Notch-3受体和Dll4的表达也均上调［23］。Köhler等［24］发现 Notch 配体 Jagged-1 激活 Notch 受体可促进2/3肝移植后的组织与血管再生，并刺激SEC的生长和分化。

3.2PDGF-Ephrin信号途径PDGF可使HSC获得促血管生成表型，即募集HSC至肝窦并增加其在肝窦内的分布，从而改变肝脏微血管的通透性与压力。应用受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼(sunitinib)阻断PDGF信号转导则可减少CCl4致大鼠肝窦血管新生，降低肝脏血管密度和门静脉压力并减轻肝纤维化病变，包括减少 α-平滑肌动蛋白(α-SMA)表达、胶原沉积和炎性渗透［25］。另一能够阻断PDGF信号通路的索拉非尼(sorafenib)对大鼠实验性门静脉高压和肝纤维化也有疗效。索拉非尼通过阻断PDGF-βR以及Raf/MEK/ERK等促血管生成信号转导途径减少门体循环侧支血管的生成，抑制门静脉高压引起的肝脏血管新生与重构，从而缓解纤维化引起的组织损伤［26］。近年来发现，PDGF诱导肝窦血管生成的作用依赖于Ephrin-B2介导的信号途径，HSC内PDGF信号转导可以上调Ephrin-B2的转录与表达，分泌至细胞膜上再作用于相邻HSC膜上的Eph-B4受体，依次通过ERK通路和转录因子KLF2等级联过程，促进HSC向ESC的迁移与肝窦微血管的发生与重构［27-28］。

3.3Leptin-Hedgehog信号途径瘦素能增加人HSC中许多缺氧诱导的因子特别是VEGF的表达，且ObRb、VEGF、α-SMA在纤维化肝脏中共同高表达，这也表明瘦素与肝纤维化血管新生之间存在密切关联［29］。Kitade等［8］以胆碱缺乏的氨基酸饲料喂养天然缺失ObR的Zucker大鼠，发现其不发生肝纤维化，而其子代(能正常表达ObR)则发生肝纤维化甚至肝硬化，并且纤维化小结周围血管出现明显的病理性重构，这进一步表明瘦素及其信号系统对肝纤维化中的血管新生与重构起促进作用。新近发现［30］，HSC可表达Hh配体和Hh通路的多种因子，且Hh信号系统处在瘦素介导的PI3K/Akt通路的下游。肝纤维化中，活化的HSC释放含有Hh配体的活性微粒，作用于SEC后改变其相关因子的基因表达，进而促进肝窦微血管新生与重构［31］。Choi等［32］最近报道，HSC释放的Hh配体激活Hh通路后可诱导SEC产生血管生成应答，并促进HSC发生上皮-间质转化，加剧肝窦病理性重构。

3.4Ang-1/Tie-2信号途径在正常氧浓度下体外活化的HSC可以表达Ang-1，而缺氧时Ang-1及其特异性受体Tie-2均明显上调［21］。体内研究显示，Ang-1/Tie-2受体系统在部分肝切除后肝窦重建以及肝坏死区域肝窦毛细血管化的发展中起重要作用，且在CCl4致肝损伤大鼠的肝组织中Ang-1的基因表达增加［33］。在小鼠胆道结扎致肝纤维化中，免疫组化结果也显示活化的HSC高表达Ang-1;而给予重组腺病毒表达可溶性Tie-2受体蛋白则抑制了血管生成和纤维化程度［34］，因为该重组蛋白可以阻止SEC上Tie-2受体酪氨酸激酶的磷酸化即阻断Ang-1/Tie-2信号转导。临床慢性丙型肝炎并肝纤维化病人的肝脏活检组织中也检测到肌成纤维样细胞高表达 VEGF、Ang-1、Tie-2等血管生成相关因子［35］。在肝纤维化慢性炎症环境中，HSC和SEC之间的Ang-1/Tie-2信号转导途径促进了HSC或MF的非定向迁移和趋化，加速了病理性血管生成的发展。

4 总结与展望

肝纤维化程度与组织微血管形态改变平行，血管生成既是慢性肝损伤后组织修复中血管重塑的表现，也与纤维化进程及并发症关系密切。HSC通过表达多种促血管生成因子以及相应的信号转导途径促进了病理性血管生成，其中的分子调控机制是抗血管生成药物干预肝纤维化的潜在靶标。

已报道的抗血管生成疗法治疗实验性肝纤维化的研究表明，抑制血管生成信号系统可以阻遏肝纤维化进程，显现较好的疗效和前景，但对于以下几点尚需深入研究:(1)调控肝纤维化血管生成的分子机制众多，其中VEGF和PDGF是较主要的两条，分别在血管发生与稳定阶段发挥关键作用。在对肿瘤的抗血管生成治疗中发现，单一抑制VEGF信号转导的长期疗效不佳，且易产生肿瘤耐药，而在双重阻断VEGF和PDGF后疗效明显改善［36］。因此以抑制血管生成来抗肝纤维化的有效治疗也应是多途径和多靶标的;(2)血管生成对于肝组织的损伤恢复也是必需的，因此在拮抗病理性血管生成的同时应能够控制抑制程度，以防过度抑制肝脏恢复与再生所需的生理性血管生成;(3)血管生成抑制剂的抗肝纤维化作用研究目前仅限在动物实验中，将其成果转化为临床应用尚需更加深入全面的生理病理及药物作用机制研究。

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