川芎嗪、顺铂对人小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡的影响及机制探讨

黄 波,郎贤平,王晓东

(辽宁医学院附属第一医院,辽宁锦州 121000)

小细胞肺癌手术治疗效果差,虽然对化疗药物敏感,但很快会产生耐药。川芎嗪是川芎的有效成分之一。顺铂是常用化疗药物,对小细胞肺癌有一定疗效,但后期易出现耐药。有研究表明,化疗药物与川芎嗪联合应用,可提高某些恶性肿瘤的治疗效果[1]。我们的前期研究证实,川芎嗪联合顺铂可抑制小细胞肺癌细胞株增殖[2]。为进一步研究其机制,2009年 6月 ～2010年 9月,我们观察了川芎嗪、顺铂联合应用对人小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡的影响,并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 人小细胞肺癌细胞株NCI-H446。盐酸川芎嗪注射液,顺铂注射液。小牛血清和RPMI1640培养基,p53和Bcl-2一抗。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组与培养 NCI-H446细胞株在含10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。将细胞用胰酶消化,制成单细胞悬液(1×105/m l),然后分为A、B、C、D组,分别接种于6孔板,每组3个平行孔,每孔接种细胞悬液2 ml。A组常规培养,B组加入川芎嗪培养液100μg/ml,C组加入顺铂培养液2 μg/ml,D组加入上述浓度的川芎嗪及顺铂培养液,均继续培养72 h。

1.2.2 凋亡细胞检测 吸去各组上清液,常规消化细胞;1 500 r/min离心5min,弃上清;PBS重悬细胞后,移至EP管中,1 500 r/min离心5 min。加5 μl的AnnexinⅤ-FITC溶液和2.5μl的PI至100μl细胞混悬液中,混合后室温避光反应30 min,加入反应缓冲液 400μl,上流式细胞仪检测。

1.2.3 各组细胞p53、Bcl-2蛋白检测 采用Western blot法,按试剂盒说明书操作。以NC膜上出现清晰的棕褐色条带为阳性,用凝胶成像系统对显色条带扫描的灰度值与 β-actin灰度值的比值表示p53、Bcl-2蛋白表达量。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。组间比较用 χ2检验及方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率比较 A组NCI-H446细胞凋亡率为5.23%±1.01%,B组为16.37%±1.23%, C为19.2%±1.51%,D组为21.2%±1.79%。B、C、D组与A组相比,P均＜0.01;D组与B、C组相比,P均＜0.05。

2.2 各组细胞Bcl-2、p53蛋白表达比较 见表1。

表1 各组细胞Bcl-2、p 53蛋白表达比较(±s)

表1 各组细胞Bcl-2、p 53蛋白表达比较(±s)

注：与A组相比,＊P＜0.05;与B、C组相比,△P＜0.05

组别 Bcl-2 p53 A组 0.87±0.003 5 0.19±0.002 3 B组 0.58±0.004 8＊ 0.31±0.001 4＊C组 0.32±0.003 9＊ 0.46±0.002 5＊D组 0.23±0.001 9＊△ 0.62±0.002 7＊△

3 讨论

肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病,也是细胞凋亡异常的疾病。细胞凋亡状态及其调控基因的异常,可导致细胞生态平衡紊乱,参与肿瘤的发生发展。细胞凋亡的抑制是肿瘤发生的原因之一[3]。

川芎嗪具有抑制肿瘤新生血管形成的作用[4],其机制与促进免疫功能及抑制诱导细胞凋亡有关。有研究[5]观察到川芎嗪有抑制肺腺癌 A549细胞增殖的作用,其抑制 A549细胞增殖的机制与其诱导细胞凋亡有关,并与化疗药物有协同作用。顺铂主要作用于DNA链间及链内交链,形成顺铂-DNA复合物,干扰DNA复制,或与核蛋白及胞质蛋白结合。本研究结果显示,B、C、D组与A组相比,细胞凋亡率明显上升,D组较B、C组上升。即川芎嗪、顺铂联合应用,细胞凋亡率明显高于单独用药。

Bcl-2是特异性抑制细胞凋亡的基因[5]。Bcl-2过表达可使细胞凋亡受抑制,细胞存活期延长并扩增,这是肿瘤发生的重要机制之一[6]。本研究结果显示,B、C、D组与A组相比,NCI-H446细胞Bcl-2蛋白表达明显降低,且D组低于B、C组。说明川芎嗪、顺铂均可降低小细胞肺癌细胞Bcl-2蛋白表达,两者联合应用抑制Bcl-2蛋白表达的能力进一步增强。抑癌基因 p53突变是人类癌症中最频发的基因事件之一[7],且与癌症的演变过程密切相关。在肺癌中p53突变率为 60%～70%,对肺癌的早期诊断、预后判断和疗效观察均有重要意义[8]。本研究结果显示,B、C、D组与A组相比,NCI-H446细胞p53蛋白表达明显增高,D组高于B、C组。说明川芎嗪、顺铂均可增强小细胞肺癌细胞的 p53蛋白表达,两者联合应用可使 p53蛋白表达进一步加强。

综上所述,川芎嗪、顺铂联合应用,小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡明显增加,可能与其降低小细胞肺癌细胞中Bcl-2蛋白表达、增强p53蛋白表达有关。

[1]张会军,阎蕴力,阴梅云.川芎嗪对依托泊苷诱导小细胞肺癌细胞凋亡的增敏作用[J].实用肿瘤杂志,2004,19(3)：229-232.

[2]黄波,刘志良,王晓东.川芎嗪、顺铂对小细胞肺癌 NCI-H446细胞株体外增殖的影响[J].山东医药,2010,50(42)：72-73.

[3]张晓晖,姚天明,黄高昇.细胞凋亡的最新研究进展[J].第四军医大学学报,2002,23(Suppl 1)：42-44

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