介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞的试剂筛选及条件优化

陈 罡,党裔武,罗殿中

(广西医科大学第一附属医院,广西南宁 530021)

RNA干扰(RNAi)已广泛用于沉默或降低靶基因及靶蛋白的表达。小干扰RNA(siRNA)必须进入细胞内才能发挥对基因的沉默作用 ,将外源性siRNA高效地转入靶细胞是基因抑制成功与否的关键。基因siRNA转染方法众多,如磷酸钙沉淀法、电穿孔、脂质体法、显微注射法、逆转录病毒法、Magnetofection法等[1]。Magnetofection法是采用磁性纳米微粒(Nanoparticles)与siRNA结合成磁性复合体,在磁力的作用下进行细胞转染,该方法还可与其他转染方法如脂质体法结合使用,提高siRNA转染效率[2]。2010年 7月,我们比较了 7种转染试剂介导表皮生长因子受体(EGFR)siRNA转染肝癌HepG2细胞后的基因敲除率,并对转染条件进行了优化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌HepG2细胞、FBS、DMEM培养基。靶向EGFR及GAPDH特异性siRNA、EGFR scrambled siRNA、Opti-Mem、Lipofectamine 2000、siPORT Amine、ICAFectin 442、N-TER nanoparticle、X-tremeGENE、polyMagnetofection、combiMAGnetofection转染试剂,cDNA第 1链合成逆转录试剂盒, CellTiter96 AQueous One Solution试剂盒,siGLO和TOX阳性转染试剂盒等。

1.2 方法

1.2.1 EGFR siRNA的合成 EGFR siRNA由Invitrogen设计并合成,序列为3′-GCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTAT-5′。阳性GAPDH siRNA购自Invitrogen。Scrambled siRNA通过www.sirnawizard. com/scrambled2.php设计,并行blast检验,由Eurogentec合成。

1.2.2 细胞培养 HepG2细胞加入含10%FBS的DMEM培养基,37℃、5%CO2培养箱中培养传代。1.2.3 EGFR siRNA转染 采用不同转染试剂进行转染。初始细胞接种密度为 5×104/孔,EGFR siRNA终浓度为40 nM,于24孔板中转染48 h及72 h,筛选作用最佳的试剂。然后,选择不同剂量的最佳试剂、siRNA浓度以及正反向转染进行测试。设置Mock对照组(加入siRNA稀释液Opti-Mem,无转染试剂及siRNA)及空白对照组(无任何其他试剂)。由于内参基因GAPDH在HepG2细胞中表达稳定[3,4],故选取靶向GAPDH siRNA为转染阳性对照组,转染后测定GAPDH mRNA敲除率。同时GAPDH对细胞生长增殖无影响,故转染后测定细胞增殖情况,评估转染试剂对细胞生长的影响。用CellTiter96 AQueous One Solution试剂盒检测细胞存活率,用siGLO和TOX阳性试剂盒检测转染率。

1.2.4 EGFR mRNA检测 采用实时定量RT-PCR技术。根据已知基因序列自行设计EGFR、GAPDH及β-actin引物。GAPDH为EGFR mRNA敲除实验内参照;β-actin为GAPDH mRNA敲除实验内参照。收集各组细胞,用ABIPRISM 6100 p repstation法抽提细胞总RNA,用ND-1000 NanoDrop检测RNA质量及浓度。取总RNA各200 ng,加入到10μl的RT反应体系中进行逆转录反应。取2μl的cDNA进行PCR,观察溶解曲线。所有实验重复 3次。采用ΔΔCp法分析结果,其中ΔCp为每一样本EGFR mRNA的Cp值与自身内参GAPDH mRNA Cp值的差值,即CpEGFR-CpGAPDH,ΔΔCp为siRNA组样本的ΔCp与阴性对照组样本的ΔCp的差值(ΔCpsiRNA组-ΔCp对照组)。EGFR基因敲除率=(1-1/2ΔΔCp) ×100%[5]。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。样本均数比较用 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同转染试剂的EGFR基因敲除率 Lipofectamine 2000、siPORT Amine transfection、combiMAGnetofection在转染72 h后EGFRmRNA敲除率均超过65%,其中combiMAGnetofection敲除率最高,见表1。

表1 7种转染试剂平均EGFR m RNA敲除率比较(±s)

表1 7种转染试剂平均EGFR m RNA敲除率比较(±s)

注：Mock对照加入相应siRNA稀释液Opti-Mem,无转染试剂及siRNA;空白对照仅为细胞。

试剂 基因敲除率(%) 48 h 72 h LipofectamineTM 2000 65±2 68±6 siPORT TM Amine Transfection Agent 53±2 69±2 ICAFectin TM 442 siRNA transfection reagent 47±2 57±1 N-TER TM Nanoparticle siRNA Transfection System 45±5 57±10 X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent 35±6 63±3 polyMagnetofection TM-100 42±2 62±2 combiMAGnetofection TM reagent-500 75±2 76±3 Mock对照 1±1 0±2空白对照 3±1 3±1

2.2 combiMAGnetofection的优化转染条件 分别用0.5、1、2μl的combiMAGnetofection及8、40、200 nM的EGFR siRNA转染72 h,结果显示,2μl combiMAGnetofection及200 nM EGFR siRNA的组合对基因沉默效率最高(90%±1%),但正向转染基因敲除率与同条件反向转染的基因敲除率相近(P＞0.05),见表2。

2.3 细胞存活率及转染率 用2μl combiMAGnetofection及200 nM转染阳性对照GAPDH siRNA 48 h及72 h的基因沉默率为 90%±5%、93%±8%,细胞存活率为 95%±7%及 94%±8%,与转染scrambled siRNA的细胞存活率相近(48 h为96% ±8%,72 h为95%±6%),证明该转染方法细胞毒性小。使用该转染条件,48 h转染率 ＞87%,72 h转染率＞95%。

表2 不同剂量combiM AGnetofection、不同浓度EGFR siRNA、正反向转染EGFR m RNA敲除率比较

3 讨论

siRNA转染的方法众多,但各有优缺点。磷酸钙沉淀法将氯化钙、RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合,形成不溶的磷酸钙颗粒,该颗粒黏附到细胞膜并通过胞饮进入靶细胞的细胞质,颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要,该方法重复性差,转染效率低。电穿孔法的原理是通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子,因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞,一般成功的电穿孔过程都伴随高水平的细胞毒性。显微注射法使用微吸管吸取siRNA溶液,在显微镜下将siRNA注射进细胞核,转染率高,对细胞无毒害,但技术要求高,操作繁琐。逆转录病毒法转染效率高,但构建病毒载体耗时长且价格昂贵,尤其不适合于有效片段的筛选实验[1]。阳离子脂质体带正电,可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面,容易透过细胞膜,在各种体外培养细胞的 RNA干扰实验中得到了广泛的应用[6],但仍有一定的细胞毒作用,而且转染效率低 。Magnetofection方法在磁力的作用下进行siRNA转染,还可与其他转染方法结合使用,提高siRNA转染效率[2]。本研究发现,Magnetofection联合Lipofectamine2000,即combiMAGnetofection介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞48 h及72 h,都获得了比其他方法更高的基因敲除率,为siRNA转染提供了新的介质选择。

基因敲除率受转染方法、转染细胞状态、siRNA浓度、转染试剂的用量、转染复合物的孵育时间、培养液中血清和抗生素含量等影响[1]。转染试剂与siRNA过量可引起细胞形状改变,细胞脱落,甚至死亡,直接影响RNAi的效率,故对转染条件进行优化是成功的RNAi实验的前提。本研究发现,combiMAGnetofection介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞最佳的实验条件是2μl combiMAGnetofection/200 nM siRNA/24孔板/72 h,EGFR mRNA敲除率达90%。由于EGFR本身对细胞增殖有影响,故本实验使用阳性GAPDH siRNA来检验combiMAGnetofection转染细胞的活力。结果显示,在48 h及 72 h,细胞存活率分别为 95%±7%及 94% ±8%。说明combiMAGnetofection转染对细胞损伤小,细胞毒性效应低。

反向转染与正向转染的区别是后者需在转染前1 d接种细胞铺板,培养24 h后再加转染复合物;前者则是先加入转染试剂和siRNA混合物在培养板上共同温育数十分钟,然后加入细胞铺板培养,其优点是节约培养时间[7],对某些贴壁重叠生长的细胞,可使其完全接触siRNA混合物,提高转染率。但本实验并未发现逆向转染与正向转染的差别。

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