胰岛素样生长因子-1对兔动脉粥样硬化血管平滑肌细胞凋亡的影响

刘福林,周玉娟,刘 莉,许金鹏

(1河北大学附属医院,河北保定 071000;2河北大学基础医学院)

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是由70个氨基酸残基构成的单链蛋白,编码基因在人类定位于 12号染色体。IGF-1可与IGF-1受体(IGF-1R)及其结合蛋白(IGFBP)结合。IGF-1的作用受IGFBP、p13-kinase、蛋白激酶C、IL-1等多种活性因子的影响[1]。IGF-1具有细胞分化、增殖功能和胰岛素样代谢作用。在动脉粥样硬化(AS)的发生发展中,IGF-1涉及到平滑肌细胞增殖迁移、脂质沉积、炎症反应、血管再生及细胞外基质重组等。本研究观察了IGF-1对兔动脉粥样硬化血管壁平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和饲料 健康日本大耳白兔共 24只,雌雄不限,体质量 2.5～3.8 kg。普通饲料配方为标准兔饲料,高脂饲料配方为标准兔饲料92.0%、胆固醇2.0%、花生油6.0%。

1.1.2 实验药物、试剂 IGF-1,辛伐他汀。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)试剂盒。TUNEL试剂盒,DAB试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将 24只日本大耳白兔分笼适应性喂养1周后随机分为正常组、模型组、IGF-1组及阳性对照(辛伐他汀)组,各6只。

1.2.2 兔动脉粥样硬化模型制作及取材 每日上午将高脂饲料喂给模型组、IGF-1组及辛伐他汀组白兔(2.5 mg/kg),正常组白兔喂给相应剂量的普通饲料。高脂饲料喂养 1周后,模型组、IGF-1组及辛伐他汀组行股动脉内膜剥脱术,剥脱腹主动脉、股动脉、骼动脉内皮;正常组家兔麻醉后切开皮肤,分离股动脉,结扎近端血管,不做内皮剥脱。模型组术后继续给予高脂饲料,IGF-1组及辛伐他汀组术后分别给予高脂饲料加0.1 mg/ml的IGF-1因子0.1 ml腹腔注射、辛伐他汀悬浊液按2.5mg/kg(辛伐他汀片碾碎制成1 mg/ml的悬浊液)经胃管灌胃。正常组术后普通饲料喂养加等剂量生理盐水灌胃。12周后实验兔用25%乌拉坦4ml/kg经耳缘静脉注射麻醉,沿正中线剪开,腹腔静脉取血,离心分离血清, -20℃保存,用于血脂检测。在相同部位取一段长约1 cm的腹主动脉,冷生理盐水冲洗,15%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片后行凋亡细胞检测。

1.2.3 血脂测定 用生化分析仪测定TC、TG、LDL、HDL。

1.2.4 血管壁凋亡细胞检测 采用TUNEL法。石蜡包埋的切片预处理后,滴加50μl的Tunel反应混合溶液,在湿盒中37℃孵育60min后加入50μl转化剂,37℃孵育30 min。PBS冲洗3次,加入50～100μl的DAB底物溶液,室温孵育10 min,PBS冲洗 3次。苏木素复染细胞核,封片,光镜下分析图像。在高倍视野下每张切片随机选 5个视野,用Image-Pro Plus图像分析系统,计算5个视野的Tunel阳性细胞数,计算阳性细胞百分比。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。多组间比较用单因素方差分析;两组间比较,方差齐用LSD方法,方差不齐则用Dunnett T3方法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血脂检测结果 各组血脂检测结果比较见表1。

表1 各组血脂检测结果比较(mm ol/L,±s)

表1 各组血脂检测结果比较(mm ol/L,±s)

注：与模型组相比,＊P＜0.05;与辛伐他汀组相比,△P＜0.05

组别 TC TG HDL LDL正常组 5.52±3.28＊ 0.67±0.24＊△ 0.89±0.71＊△ 1.71±1.25＊△模型组 27.17±10.66△ 2.01±0.57 3.24±0.27 12.48±3.54△IGF-1组 26.11±2.70△ 1.05±0.37 3.32±0.01 14.20±1.81△辛伐他汀组 11.28±4.17＊ 1.48±0.33 2.38±0.63 5.65±1.88＊

2.2 凋亡细胞检测结果 正常组、模型组、IGF-1组、辛伐他汀组的凋亡细胞分别为 0.148%± 0.095%、40.167%±8.931%、6.333%±4.546%、44.833%±12.687%;模型组与正常组及IGF-1组相比,P均＜0.05;辛伐他汀组与正常组及IGF-1组相比,P均＜0.05。

3 讨论

研究[2]表明,生长激素、IGF-1轴对物质代谢起着重要的作用。IGF-1通过降低生长激素、升调胰岛素受体等途径增加脏器、组织对胰岛素的敏感性,调节糖、脂代谢。人出生后随年龄的增长,血清IGF-1水平缓慢升高,50岁以后,血清IGF-1水平有一个缓慢下降的趋势。刘岳鸿等[3]研究发现,老年人生长激素、IGF-1轴的活性下降可以导致血糖、血脂的异常,可能是糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病等疾病发生发展的原因之一。

在AS初期,血管平滑肌细胞过度增殖是AS形成的重要步骤。血管壁细胞数量增多、内膜增厚、管腔变窄,除了与VSMC过度增殖有关,还与其凋亡率下降导致的细胞累积、数量增多密切相关[4]。因此,在病变初期调节VSMC凋亡可能成为抗AS的途径之一。他汀类药物可以诱导VSMC凋亡,减轻早期AS后的内膜增厚,预防血管再狭窄。

在AS进展期及后期,VSMC凋亡是导致粥样斑块破裂引发心血管事件的首要原因。首先,大量的VSMC凋亡可导致基质Ⅰ型胶原的合成减少,使斑块纤维帽变薄,造成斑块不稳定,易发生破裂,引起严重的临床并发症[5]。其次,凋亡的 VSMC不易清除,残余部分成为钙化基质囊泡的主要来源,引起斑块钙化。另外,VSMC凋亡的早期磷酸烯醇丙酮酸盐暴露于细胞表面,在凝血因子Ⅴ、Ⅶ的参与下,可作为血栓形成的底物激活血小板而引起血栓形成[6]。最后,VSMC凋亡可导致IL-1及IL-8释放和单核细胞趋化蛋白-1上调,引起过多的巨噬细胞趋化,而残余物质的清除未见增加,巨噬细胞产生的机体活性氧簇(ROS)及分泌的巨噬细胞—集落刺激因子和TNF-α又促进VSMC的凋亡,形成恶性循环[7]。IGF-1通过抑制VSMC凋亡来稳定粥样斑块,减少AS晚期炎症、钙化、血栓形成。

AS的高危因素如高脂血症、高血压、糖尿病及其并发症等与 IGF-1表达密切相关。本研究发现, IGF-1对AS有一定的防治作用,并能在AS形成晚期维持斑块稳定性,其机制可能与减少VSMC凋亡有关,为临床上试用人重组IGF-1治疗AS等相关疾病提供了理论依据。

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