HPLC法测定南方红豆杉种子中紫杉醇的含量

张俭俭吴叶红

（1中国人民武装警察部队学院医院药剂科，河北 廊坊 065000；2开滦（集团）有限责任公司医院，河北 唐山 063000）

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695-2996高效液相色谱仪，Empower工作站；KQ 3200DE型数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；EYELA旋转薄膜蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；电子天平（0.1mg BT 124S，0.01mg BP 211D，德国赛多利斯有限公司）；M ili-Q超纯水仪。

1.2 南方红豆杉种子采自江西，由河北医科大学药学院聂老师鉴定为Taxus chinensis var.mairei，样品保存于河北医科大学药学院标本室。1号为2004年采；2号为2006年采；3号为2009年采。紫杉醇对照品自制，NMR鉴定其结构（纯度＞98%，HPLC归一化法）。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适应性试验

色谱柱：Whatman C18(250 mm×4.6 mm，5.0μm)。流动相：乙腈-水（35∶65-80∶20）梯度洗脱，运行时间30 min。柱温：30℃。流速：1m L/min。紫杉醇检测波长为227 nm。进样量为20μL。在该色谱条件下测定紫杉醇对照品溶液，南方红豆杉种子供试品溶液，色谱图见图1。如图所示，紫杉醇达到基线分离，理论板数分别为9 161，分离度分别为1.83。

2.2 对照品溶液及供试品溶液的制备

对照品溶液的制备 精密称取对照品紫杉醇 3.40 mg，置于10m L量瓶中，色谱甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得紫杉醇对照品溶液（340μg/m L）。

供试品溶液的制备取南方红豆杉种子细粉100 g（过40目筛），取该细粉5 g，精密称定，置于三角瓶中，加甲醇50m L，称重，超声提取45m in，放冷，用甲醇补充减失的重量，滤过（0.45μm微孔滤膜），取续滤液备用。

2.3 线性范围

取“2.2”中制备的对照品溶液1.0m L，采用倍比稀释法制成系列质量浓度的溶液，在“2.1”色谱条件下，取20μL注入液相色谱仪，分析并记录结果(色谱峰面积)。以对照品浓度（X）(μg/m L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得紫杉醇回归方程为Y=3.93×104X－2.02×104，r=0.999 6，线性范围：8.5～51.0μg/m L。

2.4 精密度试验

图1 紫杉醇对照品（a）和样品色谱图（b）（＊taxol）

取供试品约5 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，每次20μL，按“2.1”项下方法测定并计算含量。结果：紫杉醇含量的RSD为0.46%。

2.5 重复性试验

取同一批药材，按“2.2”项下方法，重复6次取样制备供试品溶液，按“2.1”项下方法测定并计算含量，紫杉醇含量的RSD为1.68%。

2.6 回收率实验

取已测知含量的同一批药材6份，每份约0.25 g，精密称定，按约等含量精密加入紫杉醇对照品，按“2.2”项下方法处理并测定紫杉醇含量，计算平均回收率，结果紫杉醇的平均回收率为99.7%，RSD为1.57%（n=6）。结果见表1。

2.7 稳定性实验

取供试品约5 g，精密称定，按“2.2”项下方法处理得供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、24 h测定紫杉醇，记录其峰面积，计算6次进样紫杉醇峰面积的RSD为1.63%，表明供试品溶液在24 h内含量基本保持稳定。

表1 回收率实验 (n＝6)

2.8 样品含量测定

对不同年份采集的3批南方红豆杉种子按“2.2”项下方法处理，在“2.1”色谱条件下进行测定（n=3），计算样品中紫杉醇的含量，结果：2004、2006和2009年采集的南方红豆杉种子中紫杉醇的含量分别为0.019 6%、0.021 2%和0.020 5%。

3 讨论

3.1 提取溶剂与方法的考察

比较了不同提取方法（索氏回流、连续加热回流和超声）、提取溶剂（甲醇、乙醇、二氯甲烷以及二氯甲烷-甲醇不同配比，如：3∶1，2∶1，1∶1），以及不同超声提取时间（15、30、45、90m in）对提取效率的影响，结果表明10倍量甲醇超声提取45min时各色谱峰的响应值不再增加，且方法稳定，重现性好。

3.2 色谱条件的优化

比较了以下3种色谱柱：Whatman C18(250mm×4.6mm, 5.0μm)，Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6 mm，5.0μm)，Hichrom C18(250mm×4.6mm，5.0μm)，结果表明色谱柱Whatman C18(250mm×4.6mm，5.0μm)能使药材中紫杉醇达到较好的基线分离。流动相方面，甲醇-水体系无法实现紫杉醇的基线分离，而采用乙腈-水体系，通过调整梯度洗脱的时间和比例，则能使大多数成分达到良好分离。

本研究测定了不同年份采集的3批样品中紫杉醇的含量，实验结果表明：3批样品中紫杉醇的含量略有差异但不大，说明药材在保存得当的情况下，紫杉醇含量相对稳定。测定方法准确、灵敏、重复性好，为南方红豆杉种子中紫杉醇的提取纯化及药材的进一步研究与开发提供了依据。

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