原发性肝癌组织中SOX7mRNA的表达*

翟倩倩,岳素文,张 玲,黄长山,崔 宏,王永峰,陈香梅,吕全军#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室郑州 450001 2)河南省肿瘤医院肝胆外科郑州 450008 3)北京大学医学部病原微生物学系 北京 100191

#通讯作者,男,1962年10月生,博士,教授,研究方向:营养与疾病,E-mail:lqjnutr@zzu.edu.cn

世界范围内,原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率位居恶性肿瘤第5位,死亡率居第 2位,仅次于肺癌,该病缺乏有效的治疗措施并且易复发。我国年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的55%[1]。HCC的发生和发展是一个多因素、多阶段、多基因变异累积的复杂过程。染色体8p23.1和8p22上基因的缺失在肝癌中多有发生[2]。Wnt通路负性调控因子SOX 7基因的整个启动子区及编码区均位于8p23.1区域内。SOX7的异常低表达与包括结肠癌、乳癌及前列腺癌在内的许多肿瘤的发生发展密切相关[3-4]。作者采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测了肝癌细胞系及HCC组织中SOX7mRNA的表达情况,并分析了其与HCC临床病理特征之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 7种肝癌细胞系HepG2、SNU449、SNU182、SMMC-7721、HUH-7、PLC-PRF-5及Hep3B由北京大学病原微生物学教研室提供。7种细胞于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液、37℃及含体积分数 5%CO2的培养箱中培养,2～3 d换液传代一次。

1.1.2 标本来源 收集河南省肿瘤医院 2009年 5月至2010年4月40例HCC患者手术切除标本,患者均有肝硬化,男性,年龄 35～76岁,＞45岁 32例。40例均取其癌灶及相应癌旁3～5 cm处正常组织。标本离体0.5 h内立即取材后放入液氮内冻存。按国际抗癌联盟(UICC)提出的肝癌临床分期TNM分类标准:Ⅰ期 11例,Ⅱ期 2例,Ⅲ期 27例;有门静脉癌栓18例,无门静脉癌栓22例;轻、中、重度肝硬化分别为 1、12和 27例;存在肝内播散 16例,无 24例。所有标本的取用均征得患者同意,均经术后病理学确诊,患者术前未接受过放化疗。

1.2 SOX 7 mRNA的检测 Trizol试剂(Invitrogen公司),逆转录试剂盒(Fermentas公司),Real-time PCR试剂及仪器(德国Roche公司Light Cycler 480 SYBR Green IMaster)。Trizol法提取组织和细胞系总RNA,再按照逆转录试剂盒说明逆转录成cDNA,于-20℃冰箱中保存备用。以cDNA为模板,HMBS为内参,采用Real-time PCR对SOX7 mRNA进行扩增。SOX7和HMBS引物序列见表1。扩增体系20 μL,其中罗氏Mix 10μL,上下游引物各0.5μL,双蒸水8μL,cDNA 1μL。反应条件:95℃预变性10min; 95℃变性 30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸30 s,84℃15 s采集荧光,40个循环;最后70℃延伸7min。每个样本重复2个复孔,取2次循环次数(Ct)的平均值作为终值。Ct值是指产生的荧光量超过一个固定阈值时的循环次数。SOX7 mRNA表达水平=2-ΔCt, ΔCt=Ct(SOX7)-Ct(HMBS)。癌组织与相应正常组织中SOX7mRNA表达水平的比值＜0.5为低表达, 0.5～2.0为无差异,＞2.0为高表达[5]。

表1 引物序列

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0进行统计分析,癌和正常组织SOX7mRNA表达水平的比较采用配对t检验,不同临床病理特征癌组织中SOX7 mRNA表达的比较采用秩和检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肝癌细胞系中SOX 7m RNA的表达情况 以SOX7mRNA在7例正常肝组织中表达水平的平均值为1,对7株肝癌细胞系中SOX7mRNA的表达水平进行校正,结果表明HepG2、SNU449、SMMC-7721和HUH-7中SOX 7 mRNA的表达水平分别为0.061、0.057、0.032和0.025,SNU182、PLC-PRF-5和Hep3B中则检测不到SOX7mRNA的表达。

2.2 HCC和正常组织中SOX7 mRNA的表达情况 HCC组织中SOX7 mRNA的表达水平为(1.189±1.213),低于正常组织的表达水平(1.821±1.718)(t=2.040,P=0.048)。HCC组织中SOX7 mRNA低表达19例(47.5%),与正常组织表达无差异17例(42.5%),高表达4例(10.0%)。

2.3 不同临床病理特征HCC组织中SOX 7 m RNA的表达 见表2。

表2 不同临床病理特征HCC组织中SOX 7mRNA的表达 例

3 讨论

经典Wnt信号通路也称为Wnt/β-catenin信号通路,是一条极其保守的信号转导通路,存在于从线虫到人类的各种动物体内,参与胚胎发育及细胞增殖与分化等正常生理过程[6],其异常持续激活与许多肿瘤的形成有关,包括脑瘤、乳癌、结肠癌、皮肤癌、肺癌、肾癌和肝癌等[7]。SOX基因家族是Wnt信号通路重要的转录调控因子,参与性别决定、性别分化、神经发生、软骨形成以及胸腺细胞的分化等过程[2]。SOX基因根据HMG盒基因序列的同源性分为10个亚组,SOX7是SOX家族F亚组的成员之一。当Wnt分子存在,开启Wnt/β-catenin信号通路导致β-catenin在细胞质内积聚,随后转移入细胞核时,SOX 7通过直接与TCF/LEF竞争结合β-catenin,从而抑制TCF/LEF/β-catenin介导的Wnt信号通路下游靶基因的激活[6]。或者当β-catenin在细胞质内积聚时,SOX7通过促进β-catenin突变,使其在胞质中被GSK-3β、Axin和APC组成的降解复合体磷酸化,随后经泛素化途径被蛋白酶体识别并降解,从而抑制 Wnt信号通路的激活[8]。已有研究[2-3,9]报道,SOX7低表达与许多人类肿瘤(如前列腺癌、结肠癌、原发性乳癌、原发性肾癌及原发性肺癌等)的发生发展有关。

该研究结果显示,HepG2、SNU449、SMMC-7721及HUH-7肝癌细胞系中SOX7 mRNA的表达水平低,SNU182、PLC-PRF-5及Hep3肝癌细胞系中则检测不到SOX7mRNA的表达。作者进一步研究发现,与正常肝组织相比,SOX7 mRNA在47.5%(19/40)的HCC组织中低表达;HCC组织的临床分期越高, SOX7mRNA的表达水平越低。说明HCC组织中SOX7mRNA低表达,且与HCC病情恶性程度有关。

SOX7基因在肝癌中表达缺失,可能导致 βcatenin在核内积累。有研究[10-11]证实,正常肝组织中β-catenin表达位于细胞膜上,细胞质内有弱表达,无核内表达;而肝癌组织中β-catenin则可以在细胞质或细胞核中表达;β-catenin在胞膜、胞质中的表达多见于高、中分化肝癌,核表达多见于中、低分化肝癌。β-catenin在核内可结合转录因子TCF/ LEF,介导靶基因c-myc、cylinD1转录,促进肿瘤细胞增殖[12]。SOX7基因在HCC组织中表达异常,可能通过β-catenin间接参与肝癌细胞的去分化过程及肝癌细胞增殖和病情恶化。

综上所述,肝癌细胞系和HCC组织中SOX7 mRNA表达水平下调,且与HCC的恶性程度有关,但SOX7与Wnt信号通路的关系及两者在HCC发生、发展中的作用机制还有待进一步研究。

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