乙醇对兔骨髓间充质干细胞6种神经递质mRNA表达的影响*

王义生,张 振,张 鑫,赵国强,李月白

1)郑州大学第一附属医院骨科郑州 450052 2)郑州大学基础医学院生物化学教研室郑州 450001 3)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州 450001

△男,1951年2月生,教授,研究方向:骨坏死的发病机制与防治、关节脊柱外科,E-mail:wangyisheng@zzu.edu.cn

股骨头坏死是危害人类健康的重要疾病之一,而酒精性股骨头坏死的发病率居高不下。骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能,其分化方向受多种神经递质的影响。作者收集兔BMSCs,利用第3代细胞观察乙醇干预后其成纤维细胞生长因子(fibrocyte growth factor,FGF)、降钙素相关基因肽受体(calcitontin gene-related peptide receptor,CGRPR)、血管活性肠肽受体(vasoactive intestinal peptide recep tor, VIPR)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、P物质受体(substance P receptor,SPR)及过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(peroxisom proliferator-activated receptorγ,PPARγ)等基因的表达情况,探讨神经递质对成骨作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:6周龄新西兰大耳白兔(河南省实验动物中心)。仪器:25m L培养瓶(宝信生物工程公司),PCR仪(美国Biometra公司),超净工作台(苏州净化公司),倒置显微镜(日本奥林巴斯公司),u-2001型紫外分光光度仪(美国Stanorjus公司)。试剂:低糖DMEM培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),RNA提取试剂盒(Fermentas公司),无水乙醇(北京化工厂),Trizol试剂(美国Invitrogen公司),SYBR 荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)。引物由上海博尚生物技术有限公司提供,序列见表 1。

1.2 BM SCs的分离与鉴定 空气栓塞法处死大耳白兔,充分洗净后使用体积分数 75%医用乙醇完全浸泡15 min以达到消毒目的,移至超净工作台,常规消毒铺巾,严格无菌操作下取家兔四肢长骨,咬骨钳咬断其两端干骺端,使用10m L针管,以无血清低糖DMEM培养基(含青霉素100 kU/L,链霉素100 mg/L,维生素C 50 mg/L,L-谷氨酰胺1 mmol/L, Hepes 20 mmol/L)冲洗髓腔,将骨髓冲至无菌培养皿中,取一离心管加入10mL淋巴细胞分离液,骨髓铺于分离液上层,室温下1 700 r/min离心20 min,取其中间白膜单核细胞层至离心管中,加入培养基至5 mL,吹打混匀后1 000 r/min离心5 min,弃上清,加入完全DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清)4 mL,反复吹打混匀后以1×106cm-2接种于25 cm2培养瓶中[1]。取原代细胞行免疫细胞化学染色,结果CD29、CD44、CD105及CD166表达阳性而CD11、CD14、CD34及CD45表达阴性,再根据BMSCs排除鉴定法[2],鉴定为BMSCs。原代细胞培养3 d后进行首次换液,以后每隔2 d换液 1次,逐日用倒置显微镜观察细胞的形态及生长情况,待细胞长至瓶底面积的70%～80%时消化传代。

表1 引物序列

1.3 实验分组及处理 取第3代细胞随机分为2组,以 1×104m L-1分别接种于 6孔培养板中。实验组于培养基中加入乙醇至终浓度达0.09mol/L,对照组正常培养。分别于培养第 4和 7天,检测相关基因的表达。重复 5次。

1.4 BMSCs中FGF、CGRPR、VIPR、NGF、SPR及PPARγ等m RNA的检测 以Trizol法提取细胞总RNA,经RNA纯度和完整性鉴定后,用通用引物在AMV的作用下逆转录合成cDNA,行RT-PCR检测。使用荧光定量PCR进行定量检测,具体反应体系:SYBR Premix ExTaq 12.5μL,上、下游引物各0.5μL,cDNA 2μL,去离子水9.5μL。扩增条件为:95℃30 s,95℃25 s,60℃30 s,40个循环。以目的基因和内参照基因β-actin的标准品测定所得的标准曲线,计算出mRNA的绝对含量,用目的基因与β-actin的mRNA绝对含量的比值表示目的基因的相对表达量。

1.5 统计学处理 用SPSS 13.0进行数据分析,2组BMSCs中各基因mRNA相对表达量的比较采用两独立样本t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

FGF、CGRPR、VIPR、NGF、SPR及PPARγ等mRNA的检测结果见图 1和表 2、3。可以看出,实验组BMSCs中NGF、FGF、CGRPR、VIPR和SPR mRNA的相对表达量较对照组明显降低,而PPARγ mRNA的相对表达量较对照组显著增高。

图1 2组BM SCs中几种神经递质mRNA的RT-PCR结果S:实验组;D:对照组;M:Marker;1:CGRPR;2:NGF;3:SPR;4:VIPR;5:FGF;6:β-actin;7:PPARγ。

表2 2组细胞培养第4天各基因mRNA的表达

表3 2组细胞培养第7天各基因m RNA的表达

3 讨论

BMSCs能够分化为成骨细胞,在骨愈合中起重要作用,又可被不同的因素诱导分化为软骨细胞、神经细胞和脂肪细胞等。多项研究[2-4]证实 NGF、FGF、CGRP、VIP和SPR有促进MSCs增殖、成骨分化的作用。近年来,神经系统与成骨的相关性已经引起重视。Solchaga等[5]证明,FGF-2具有增强人BMSCs增殖和延迟其成骨能力丧失的作用。张贵春等[6]发现周围神经系统可以促进成骨细胞的生成,从而加速骨折愈合。高润等[7]证实神经系统对于骨代谢有着重要影响。刘勇等[8]认为 NGF、CGRP、SPR及VIP等神经递质可以通过促进成骨细胞生成、抑制破骨细胞,促进成骨过程。研究[9]证明,乙醇处理BMSCs7 d,成骨基因骨钙素表达显著降低,成脂基因PPARγ呈高表达,导致机体成骨下降,成脂增多。因此,该研究观察了乙醇处理 BMSCs 4、7 d后相关神经递质mRNA的表达。

长期大量饮酒能够引起股骨头坏死。王义生等[10]证实乙醇能够诱导小鼠骨髓基质细胞大量分化为脂肪细胞,成骨分化减少,导致股骨头内脂肪堆积,骨内压增高,血流减少,从而引起股骨头坏死。吴学建等[11]发现乙醇能够诱导人BMSCs中PPARγ表达增强,骨钙素表达减弱,PPARγ是酒精性股骨头坏死的重要致病基因之一。

作者采用新西兰大耳白兔第3代BMSCs,给予0.09mmol/L乙醇4、7 d后进行相关递质mRNA的检测,结果显示,BMSCs中FGF、CGRPR、VIPR、NGF及SPRmRNA的表达明显降低,而PPARγmRNA的表达显著增高。由此推测,在乙醇作用下,BMSCs中FGF、CGRPR、VIPR、NGF及SPR的促成骨作用将被抑制,而PPARγ促使BMSCs大量分化为脂肪细胞,从而发生股骨头坏死。

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