大肠癌组织中p16、Rb及p27基因启动子区甲基化状态检测*

原志庆,崔 静,千新来,贺国洋,郑丽丽

1)郑州大学第一附属医院内分泌科郑州 450052 2)新乡医学院病理学教研室新乡 453003

#通讯作者,女,1956年6月生,教授,博士,主任医师,研究方向:内分泌疾病的防治,E-mail:zhengli1012@126.com

大肠癌的发生过程中涉及多种癌基因和(或)抑癌基因的变化。研究[1-4]表明,细胞周期相关基因p16、Rb和p27的失活与多种肿瘤有关,它们的失活方式有缺失、突变和启动子区甲基化等。DNA甲基化是基因表达转录水平调控的重要方式之一,在限制或关闭基因表达中起重要作用。作者采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测大肠癌组织中p16、Rb和 p27基因启动子区甲基化状态,并分析其甲基化状态与蛋白产物的表达及大肠癌临床病理参数的关系。

1 材料与方法

1.1 标本收集 收集2001年1至 12月新乡医学院第三附属医院、新乡市中心医院和新乡市第二人民医院手术切除的大肠癌标本 56例,腺瘤 42例,同时切取大肠癌患者手术切缘正常组织,所有标本均经病理检验证实。56例大肠癌患者,男 31例,女 25例;年龄37～76(53.6±5.2)岁;高分化腺癌23例,中分化腺癌 30例,低分化腺癌 3例;浸润至黏膜下层 24例,肌层 32例;有淋巴结转移 23例,无33例。患者术前均未接收放疗或化疗。

1.2 主要试剂 亚硫酸钠和氢醌等为美国Sigma公司产品;基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、dNTPs和Taq DNA聚合酶等为美国Promega公司产品;RNA酶A、蛋白酶K和琼脂糖等为德国Merk公司产品;100 bp DNAMarker为美国Invitrogen公司产品;氢氧化钠为国产分析纯;PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 p16、Rb和p27基因启动子区甲基化状态检测

1.3.1 基因组DNA的提取、修饰及纯化 组织离体后立即提取基因组DNA,按基因组DNA提取试剂盒说明书操作并定量,然后按文献[5]方法略作修改进行亚硫酸氢盐修饰:取2μg基因组DNA,于20μL氢氧化钠(0.5mol/L)中37℃变性15min,加入30μL氢醌(10mmol/L)和520μL亚硫酸氢钠(3 mol/L,pH 5.0)并混匀,50℃修饰16 h后,按说明书纯化回收修饰的基因组DNA。-20℃保存备用。

1.3.2 MSP 以经过修饰并纯化的基因组DNA为模板,采用MSP方法检测各样品中p16、Rb和p27基因启动子区甲基化状态。引物序列和产物大小见表1。反应条件:95℃预变性10 min;94℃变性45 s,60℃(p16U)或65℃(p16M)或55℃(RbM和RbU)或66℃(p27M和p27U)退火45 s,72℃延伸45 s,35个循环;最后 72℃延伸 5 min。产物经 18 g/L琼脂糖凝胶电泳后观察并照相。

表1 引物序列和目的片段

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5进行统计分析,腺瘤与正常组织、不同临床病理特征大肠癌组织间 3种基因甲基化率的比较采用 χ2检验,大肠癌与正常组织间 3种基因启动子区甲基化率的比较采用配对χ2检验,大肠癌组织中 3种基因甲基化状态与蛋白表达的分析采用列联系数rp评价,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 p16、Rb和p27基因启动子区甲基化状态检测结果 见图1、表2。

2.2 大肠癌组织中p16、Rb和p27基因启动子区甲基化状态与其蛋白表达的关系 见表 3。

图1 p16(左)、Rb(中)和p27(右)基因启动子区甲基化MSP检测结果M:marker;1:甲基化;2:非甲基化。

表2 p16、Rb和p 27基因启动子区甲基化状态 例(%)

表3 大肠癌组织中p 16、Rb和p 27基因启动子区甲基化状态与其蛋白表达的关系 例(%)

2.3 p16和p27基因启动子区甲基化状态与大肠癌临床病理参数的关系 见表4。

表4 p 16和p 27基因启动子区甲基化状态与大肠癌临床病理参数的关系 例(%)

3 讨论

DNA甲基化可能通过直接和间接 2种机制调控基因表达,基因启动子区 CpG岛的甲基化可干扰一些转录因子与基因调控区的结合或抑制 RNA聚合酶活性而直接抑制基因表达;甲基化DNA与特异结合蛋白结合或甲基化改变染色质结构可间接阻碍转录因子与 DNA结合,从而抑制转录。近年来,基因启动子区CpG岛的高甲基化引起的肿瘤抑制基因失表达已成为肿瘤研究的焦点之一[6]。

作者采用MSP方法检测了56例大肠癌和42例大肠腺瘤组织中p16、Rb和p27基因启动子区甲基化状态,并分析甲基化状态改变与蛋白表达的关系,结果显示:腺瘤和癌组织中p16和 p27基因启动子区甲基化率均显著增加,而Rb基因启动子区甲基化率无明显增加,而且正常、腺瘤和癌组织中 Rb基因启动子区均呈低水平的甲基化。p16和 p27基因启动子区甲基化影响了其蛋白表达,而 Rb基因启动子区甲基化状态与蛋白表达无关联。提示大肠癌组织中启动子区高甲基化是p16和p27基因失活的主要机制,抑癌基因启动子区高甲基化可能是肿瘤发生与演进的重要事件[7]。但是,该研究结果还提示大肠癌组织中Rb基因启动子区甲基化可能在Rb的失活中不起主要作用,深入的机制有待进一步研究。

分化程度、浸润深度和淋巴结转移等是评价肿瘤特别是恶性肿瘤恶性生物学行为的重要指标。该研究结果显示:p16基因启动子区高甲基化与大肠癌的分化程度、浸润深度及淋巴结转移关系密切; p27高甲基化与淋巴结转移有关。Arnold等[8]以具有神经内分泌功能的大肠癌为研究对象的结果也显示p16可作为一个大肠癌的预后指标。

综上所述,p16和 p27基因启动子区高甲基化在大肠癌的发生、演进和转移中可能起重要作用,两者有可能成为大肠癌早期诊断和判断预后的候选标志物。

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