蛛网膜下腔神经阻滞麻醉对兔脊髓神经元形态及c-fos蛋白表达的影响

张 勇,李 霞,甘子明

1)新疆医科大学第五附属医院麻醉科乌鲁木齐 830011 2)新疆医科大学基础医学院解剖学教研室乌鲁木齐 830011

△男,1963年8月生,硕士,副主任医师,研究方向:外周神经阻滞麻醉对脊髓神经的生物学影响,E-mail:maiker123@163.com

周围神经阻滞麻醉方法简单,效果良好,对全身的生理干扰少,且经济,因此在临床上被广泛应用。人的感觉是通过神经反射传导到大脑皮质来实现的。简单神经反射由感受器、传入神经、低级中枢(脊髓)、传出神经和效应器组成;复杂神经反射则由低级中枢向高级神经中枢传导整合而完成。作者采用新西兰大白兔制备蛛网膜下腔阻滞麻醉(腰麻)模型,观察兔相应节段脊髓神经元形态的变化及c-fos蛋白的表达情况,探讨周围神经阻滞麻醉对脊髓形态和功能的影响,以指导临床麻醉的实践。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用健康新西兰大白兔30只,雌雄不限,分笼饲养,由新疆医科大学实验动物中心提供,体质量3.0～4.0 kg,置于安静、温暖(20～23℃)、避强光的环境中饲养2 d。采用随机数字表将30只大鼠分为实验组和对照组,每组15只。

1.2 动物模型的建立 将兔以俯卧位固定于手术台上,用20 g/L戊巴比妥钠按30 mg/kg从兔耳缘静脉注射麻醉。于 L5～6/L6～7棘突侧缘进针穿刺到蛛网膜下腔,见脑脊液流出后,实验组注射5 g/L布比卡因(上海禾丰制药有限公司生产,产品批号: 070309)0.8m L,对照组注射生理盐水0.8m L,溶液中均加2滴亚甲蓝。麻醉后 30 min,将兔仰面固定在手术台上,从胸骨左缘逐层切开,打开胸腔,暴露心脏,于心尖处用 12号针穿刺进入左心室,止血钳固定;用组织剪打开右心房放血;向左心室快速静脉注射生理盐水500 mL,然后快速静脉注射40 g/L多聚甲醛溶液1 000m L,清水冲净后放到大白盘中。

1.3 脊髓神经元形态学观察及c-fos蛋白检测 解剖脊柱,分离腰骶干脊髓,并将其固定于40 g/L多聚甲醛溶液中。取 L5、L6和 L7节段脊髓,石蜡包埋,4μm厚横切面切片。HE染色,显微镜下观察各节段脊髓软脊膜的改变,脊髓后角第Ⅲ、Ⅳ板层及脊髓前角第Ⅸ板层外侧神经细胞形态(胞质尼氏体数等)的变化。用免疫组化SP法检测脊髓神经元中c-fos蛋白的表达。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司,c-fos一抗试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。c-fos阳性细胞胞质和胞核呈棕黄色颗粒样着色;每张切片观察5个高倍视野,每个视野计数 100个神经元中的阳性细胞数,取其平均数为该标本的阳性细胞数。

1.4 统计学处理 应用SPSS 11.0进行分析。对资料进行正态性和方差齐性检验,资料呈正态且方差齐,采用两独立样本t检验分析2组兔脊髓神经元cfos蛋白表达的差异。采用确切概率法统计 2组家兔软脊膜水肿分层的变化。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组兔脊髓神经元形态变化比较 见图1。与对照组相比,实验组脊髓灰质前角Ⅸ板层外侧大多角细胞及后角Ⅲ、Ⅳ板层的小圆细胞胞质尼氏体减少,核偏向一端。实验组脊髓软脊膜有水肿、分层现象(12/15),对照组(2/15)没有明显变化(P＜0.001)。

2.2 2组兔脊髓神经元c-fos蛋白表达的比较 见图 2。对照组脊髓灰质前角Ⅸ板层外侧大多角细胞及后角Ⅲ、Ⅳ板层的小圆细胞有棕黄色颗粒阳性反应,密度分布均匀,色度较深,核仁浓缩呈深棕黄色, c-fos阳性细胞数为(68.9±1.4);实验组阳性表达较弱(12.3±1.6)。2组比较差异有统计学意义(t=60.352,P＜0.001)。

3 讨论

目前局麻药产生神经阻滞的确切机制尚不清楚,在表面电荷学说、膜膨胀学说和受体部位学说中,以受体部位学说受重视。该学说认为,局麻药是通过对神经细胞膜钠通道的阻滞,使钠通道失活来阻滞神经传导。研究[1]证明,钠通道是大分子糖基蛋白的杂三聚复合物,有 α、β1和 β2 3个亚单位,其中最大的 α亚单位是主要的功能单位,包括 4个相似的区段,每个区段由 6个螺旋结构的跨膜片段组成。局麻药的作用位点是位于钠通道细胞膜内侧的 α亚单位第 4个区段的第 6个片段上的氨基酸残基。

研究[2]报道,尼氏体的主要功能是合成蛋白质,包括复制细胞器和产生与神经递质有关的蛋白质、酶类以及肽类神经递质。当代谢功能出现障碍时,尼氏小体的形态可发生变化。神经元损伤、过度疲劳和衰老均能引起尼氏体减少、解体甚至消失。有文献[3]报道,坐骨神经横断常致脊髓前角运动神经元发生轴突反应,形态上表现为尼氏体溶解,核偏位等改变。该实验中,腰麻后实验组 L5～7节段脊髓后角Ⅲ、Ⅳ板层小细胞及脊髓前角Ⅸ板层外侧大多角细胞胞质中尼氏体减少,向外周移位,细胞核偏向一端。对照组脊髓神经细胞胞质尼氏体分布均匀,胞核无偏移。说明周围神经阻滞麻醉后脊髓神经细胞功能受到抑制。

细胞受损,胞质尼氏体部分水解,损害不重时可以完全恢复。麻醉本身是一个可逆的过程,当麻醉结束时神经细胞内核向中心移位,尼氏体增多并重新分布在核周围[4]。

此外,腰麻后软脊膜有水肿、分层,而对照组软脊膜无变化,提示局麻药直接作用于脊髓软脊膜后,软脊膜有血管扩张、不同程度的水肿,故应严格掌握局麻药的浓度和剂量。

正常生理情况下,多种细胞中均有c-fos基因的低水平表达,参与细胞的生长、分化和信息传导等生理功能[5]。研究[6]证实各种伤害性刺激(包括疼痛、创伤和精神心理因素等)均可诱导多种组织细胞中c-fos基因的高表达,在一定程度上,c-fos基因被诱导的数量与所受刺激强度一致,且c-fos基因表达的数量和时程随刺激强度、时间及性质而异。伤害性刺激诱导的c-fos在中枢神经系统中的表达多数情况下可被麻醉药所抑制[7]。作者的实验结果显示,对照组 L5～7节段脊髓后角Ⅲ、Ⅳ板层的小细胞及脊髓前角Ⅸ板层外侧大多角细胞中c-fos蛋白阳性细胞增多,而实验组脊髓神经细胞c-fos蛋白表达不明显。说明周围神经阻滞麻醉后,脊髓神经细胞膜的钠通道被阻滞,神经兴奋的传导被抑制,c-fos基因的诱导表达相应减少,进一步证明周围神经阻滞麻醉抑制了脊髓神经细胞的功能。

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