多囊卵巢综合征患者子宫内膜组织中同源框基因 A10蛋白的表达

管一春,杨雪峰,王兴玲,孙丽君,王雪梅,娄 华,李巍巍

1)郑州大学第三附属医院生殖中心郑州 450052 2)郑州大学第三附属医院妇产科郑州 450052△女,1977年5月生,硕士,主治医师,研究方向:生殖内分泌,E-mail:lisamayguan@126.com

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病,是无排卵性不孕的主要原因。临床中发现,经促排卵治疗, PCOS患者的排卵缺陷纠正后,妊娠率仍低,流产率则很高。研究[1]认为PCOS患者机体内分泌和代谢的异常可导致子宫内膜容受性下降,子宫内膜发育和内膜对胚泡容受性失调可成为生育能力低下和不良生殖结局的原因之一。同源框基因(homeobox gene,HOX)A10作为一种多效性转录因子参与胚胎种植的各个环节,如子宫内膜的增殖与分化、子宫内膜容受性的建立和胚胎的定位与黏附等环节,它是胚胎着床和成功妊娠所必需的[2]。作者采用免疫组化SP法检测PCOS患者不同组织分期子宫内膜HOXA10蛋白的表达情况,探索PCOS子宫容受性异常的原因,为临床研究提供新思路和依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集 2008年 10月至 2009年 10月在郑州大学第三附属医院生殖中心就诊的已婚PCOS患者20例,年龄23～33(28.5±3.3)岁。PCOS诊断依据 2003年鹿特丹标准[3]。同期就诊的已婚不孕症(不孕原因为男方因素或输卵管梗阻,拟行体外受精-胚胎移植治疗)患者26例作对照,年龄25～40(28.7±4.1)岁。月经周期性激素水平和盆腔超声检查均正常。研究对象对该研究均知情同意,且排除其他内分泌疾病,3个月内无激素类药物应用史,无心、肝和肾疾病史。

1.2 标本采集 所有患者均于月经周期的5～14 d和自然周期或使用氯米芬/人绝经期促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素方案促排卵周期的着床窗口期(阴道超声监测确认排卵后 7～8 d,血总绒毛膜促性腺激素T-HCG证实未孕)无菌操作下使用Pipelle管吸刮子宫前后壁,采集子宫内膜组织标本。根据Noyes标准判定组织学分期:PCOS增生期13例,分泌中期 7例;对照增生期 16例,分泌中期 10例。

1.3 子宫内膜病理组织学检查 将子宫内膜组织标本迅速置于体积分数 10%多聚甲醛中固定,常规脱水,梯度乙醇脱水后石蜡包埋,行HE染色。镜下观察其间质反应不良和内膜分泌反应欠佳发生情况。

1.4 子宫内膜组织HOXA10蛋白的表达 采用免疫组织化学SP法。组织切片脱蜡,抗原热修复后加入一抗HOXA10(羊抗人多克隆抗体,工作浓度为1∶50,美国Santa Cruz公司),4℃过夜,滴加生物素标记的二抗(羊抗鼠,北京中杉金桥生物技术有限公司),DAB显色,苏木素复染,封片。试剂公司提供的已知阳性片作为阳性对照,PBS代替一抗作为阴性对照。以细胞核出现棕黄色颗粒者为染色阳性细胞。每张切片随机选取不重叠的 5个高倍镜视野(×400),使用Powersite显微图像采集分析系统分别测量 HOXA10阳性区的灰度值,结果取平均值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0分析。各组子宫内膜组织中HOXA10蛋白表达的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验;PCOS和对照增生期组间质反应不良发生率以及PCOS和对照分泌中期组内膜分泌反应欠佳发生率比较采用确切概率法,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组患者子宫内膜病理组织学观察 见图1。PCOS患者间质反应不良发生率为50.0%(10/20),高于对照患者的15.4%(4/26)(P=0.022)。PCOS分泌中期组子宫内膜分泌反应欠佳发生率为85.7% (6/7),高于对照分泌中期组的10.0%(1/10)(P= 0.004)。

2.2 各组患者子宫内膜组织中HOXA 10的表达HOXA10主要表达于子宫内膜间质细胞。见图2和表1。

表1 各组子宫内膜组织HOXA 10蛋白的表达

3 讨论

PCOS患者体内异常的内分泌环境对子宫内膜形态和功能有一定的不良影响[4]。PCOS患者自然月经周期绝大部分均为无排卵周期,作者采用促排卵方案来获取其分泌中期的子宫内膜。研究结果显示,50%的PCOS患者子宫内膜表现间质反应不良,间质呈现局灶性致密,提示PCOS患者的子宫内膜对性激素的反应性下降,缺乏随激素水平变化的能力,影响蜕膜化,进而影响着床。其分泌中期的子宫内膜中,分泌反应欠佳发生率高达 85.7%,则提示PCOS患者应用促排卵治疗后,可正常排卵,但黄体功能较差,与报道[5]一致。

同源框基因属于多基因家族的转录调节基因,通过和DNA结合激活或抑制目标基因的表达。研究[6]发现,野生的小鼠胚胎不能在HOXA 10基因缺失的小鼠子宫内着床。当转染持续表达 HOXA 10的质粒时,可提高移植胚胎的着床率[7]。小鼠胚胎着床前转染HOXA 10抑制剂可降低其在子宫内膜的表达,并观察到胞饮突数量显著减少;而胞饮突形成前强化HOXA10的表达则其数量增加,HOXA 10基因可调控胞饮突的发育[8]。以上研究均提示, HOXA10基因的持续表达是胚胎着床所必需的。

李红等[9]认为 HOXA10在增生期子宫内膜低表达,分泌中期至晚期子宫内膜则高表达,且间质表达明显高于腺体。作者发现,HOXA10在正常增生期和分泌中期子宫内膜均表达,定位于间质细胞的胞核,未见腺上皮细胞的表达。研究[10]表明,不明原因不孕、输卵管积水等各种类型不孕患者,其分泌中期子宫内膜HOXA10表达较正常对照组显著下降。该研究结果显示,HOXA10在PCOS患者增生期和分泌中期子宫内膜间质细胞的胞核中均表达,呈现周期性变化,而在分期相同的子宫内膜,PCOS患者HOXA10的表达水平显著低于其对照组。

HOXA10可通过诱导其下游基因的激活或抑制而发挥作用。而研究[11]发现,PCOS患者内膜整合素 β3表达也下降。整合素 β3是目前公认的内膜容受性标志物之一[12],而 HOXA 10作为其上游基因,在植入的各过程中发挥作用,影响内膜容受性。该研究结果显示,PCOS患者增生期和促排卵治疗后分泌中期的子宫内膜,其HOXA10的表达低于正常对照。提示PCOS患者固有的低雌激素状态、促排卵治疗后的黄体期孕酮分泌减少,均可影响其内膜HOXA10的表达,进而影响其内膜容受性。PCOS患者过高的雄激素也可对抗雌激素和孕酮与相应受体的结合影响内膜HOXA 10的表达,此外雄激素可增加雄激素受体(androgen receptor,AR)的表达[13],过多的AR可直接作用内膜,使PCOS患者HOXA10表达下降,从而影响了其下游的内膜容受性相关的分子途径,导致PCOS患者妊娠率低和流产率高。

总之,HOXA10在PCOS患者子宫内膜的低表达可能参与了其内膜容受性下降的发生、发展过程。因此,未来可通过定向子宫内膜基因治疗,如在着床期调控性激素浓度,上调PCOS患者内膜HOXA10的表达,改善其内膜容受性,提高PCOS的胚胎着床率和妊娠率,降低流产率。

[1]Guzick DS.Polycystic ovary syndrome[J].Obstet Gynecol,2004,103(1):181

[2]Navaratnarajah R,Pillay OC,Hardiman P.Polycystic ovary syndrome and endometrial cancer[J].Semin Reprod Med,2008,26(1):62

[3]Nikas G,Aghajanova L.Endometrial pinopodes:some more understanding on human imp lantation[J].Reprod Biomed Online,2002,4(Supp 1 3):18

[4]Acosta AA,Elberger L,Borghi M,et al.Endometrial dating and determination of the window of implantation in healthy fertile women[J].Fertil Steril,2000,73(4):788

[5]Lindhard A,Bentin-Ley U,Ravn V,etal.Biochem ical evaluation of endometrial function at the time of implantation [J].Fertil Steril,2002,78(2):221

[6]Nakamura H,Kimura T,Ogita K,et al.Alteration of the timing of implantation by in vivo gene transfer:delay of implantation by suppression ofnuclear factor kappaB activity and partial rescue by leukemia inhibitory factor[J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,321(4):886

[7]Bagot CN,Troy PJ,Taylor HS.Alteration of maternal Hoxa10 expression by in vivo gene transfection affects imp lantation[J].Gene Ther,2000,7(16):1378

[8]Taylor H,Arici A,Olive D,et al.HOXA-10 is expressed in response to sex steroids at the time of implantation in the human endometrium[J].JClin Invest,1998,101(7):1379

[9]李红,陈士岭,邢福祺.HOXA10基因在子宫内膜组织中的表达及与不孕的关系[J].中华妇产科杂志,2002, 37(1):30

[10]陈辉,孙曙光,曲陆荣,等.不明原因不孕妇女分泌期子宫内膜Hoxa-10mRNA表达意义的研究[J].中国医科大学学报,2003,32(3):252

[11]Apparao KB,Lovely LP,Gui Y,etal.Elevated endometrial androgen receptor exp ression in women with polycystic ovarian synd rome[J].Biol Reprod,2002,66(2):297

[12]Cermik D,Selam B,Taylor HS,et al.Regulation of HOXA-l0expression by testosterone in vitro and in the endometrium of patients with polycystic ovary syndrome[J].J Clin Endocrinol Metab,2003,88(1):238

[13]Mertens HJ,Heineman MJ,Theunissen PH,et al.Androgen,estrogen and progesterone recep tor exp ression in the human uterus during themenstrual cycle[J].Eur JObstect Gynecol Rep rod Biol,2001,98(1):58