DPC4基因转染对胰腺癌JF305细胞凋亡的影响

邵丽春,郭晓钟,徐建华,邓国伟

1)解放军第 463医院消化内科沈阳 110042 2)沈阳军区总医院消化内科沈阳 110016 3)沈阳军区空军门诊部内科沈阳110015

△女,1970年2月生,硕士,副主任医师,研究方向:消化系统疾病

胰腺癌是临床常见的恶性肿瘤,以转移早、预后差为特征,5 a生存率低。DPC4为新的肿瘤抑制基因,在 50%胰腺癌中存在失活[1]。研究[2]发现DPC4基因参与细胞凋亡过程。Bcl-2和Bax是Bcl家族的成员,在凋亡过程中发挥重要作用[3]。Bcl-2可抑制细胞凋亡,延长细胞生存周期,增加细胞对多种凋亡刺激的抗性,但并不刺激细胞增生。Bax是凋亡促进基因,能够拮抗 Bcl-2抑制凋亡。作者通过脂质体介导法将pBK-CMV-DPC4质粒导入人胰腺癌细胞系JF305中,观察转染DPC4基因后JF305细胞的凋亡情况以及生长、增殖等生物学行为的改变,初步探讨DPC4基因促进细胞凋亡与抑制肿瘤细胞生长的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 ①细胞:JF305细胞由中国医科大学肿瘤研究所惠赠。②质粒:重组质粒pBK-CMV-DPC4和空白质粒pBK-CMV均由德国Hahn教授惠赠;质粒经大连宝生物公司测序后证实含DPC4 cDNA的完整全长序列,无突变及插入等改变。③主要试剂及仪器:二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司,胎牛血清购自美国Hyclone公司。鼠抗人DPC4单克隆抗体购自上海生工生物工程有限公司,荧光标记二抗、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体及鼠抗人Bax单克隆抗体及试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。BCA Protein Assay试剂盒购自美国Pierce公司。Facsort流式细胞仪购自美国BD公司。3550型酶联检测仪购自美国Bio-Rad公司。Lipofectamine2000购自LIFE Technologies公司。

1.2 实验分组 JF305贴壁细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化,台盼蓝染色计数活细胞。用脂质体转染法将pBK-CMV-DPC4和空质粒pBK-CMV分别转染JF305细胞,转染细胞经400mg/L的G418培养5～6周,筛选出抗 G418的细胞扩大培养。收集未转染、转染pBK-CMV-DPC4和转染pBK-CMV的细胞进行指标测定。

1.3 观测指标

1.3.1 流式细胞仪法检测Bcl-2及Bax蛋白的表达 分别收集 3种细胞,用含体积分数 5%胎牛血清的PBS液清洗并调整细胞浓度为2×107mL-1。取0.1mL置于流式管中标记,另取一管作空白对照。加入鼠抗人Bcl-2、Bax单克隆抗体(1∶50稀释)混匀,4℃过夜。加入荧光标记的二抗 3μL,避光,室温孵育30min,上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.3.2 Western blot法检测DPC4蛋白的表达 分别收集 3种细胞,用 PBS清洗 2次,加入细胞裂解液,混匀,用刮匙刮取,移入1.5m L EP管中,置于冰上15 min,于低温离心机中13 000 r/min离心10 min,取上清,-20℃冻存。用BCA Protein Assay试剂盒测定样本上清液中蛋白浓度,然后进行垂直平板电泳。分离胶80 g/L,浓缩胶40 g/L。电泳后,将凝胶、滤纸及硝酸纤维素膜浸入转移缓冲液中平衡30min,之后利用Mini-ProteinⅡ型电转槽进行转印,100 V恒压转印80min。转印结束后,取下硝酸纤维素膜用含40 g/L脱脂奶粉的Tween20-PBS溶液室温封闭1.5 h。滴加1∶200鼠抗人DPC4单克隆抗体,室温下振荡孵育1 h。显影拍照。用Graph-Pad PRISM软件扫描分析图像,计量阳性条带的灰度值。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖率 取处于对数生长期的 3种细胞,常规消化配置成单细胞悬液。以1× 103/孔接种于 96孔板中,每种细胞设 24孔,以培养液为空白对照,重复 5块板。常规CO2孵箱中培养48 h后取出其中一块板,每孔加入5 g/L的MTT 20 μL,继续培养4 h,每孔加入150μL DMSO,振荡10 min使MTT充分溶解。用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm的吸光度(A)值,计算细胞增殖率,增殖率=(实验组A值/对照组A值)×100%。以后每24 h取一块板按上述步骤进行测定,每组测定5次。

1.3.4 细胞周期测定 采用流式细胞术检测细胞周期。将 3种细胞制成单细胞悬液 1×106mL-1,上机测定细胞周期。重复 3次。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计学处理。3组细胞DPC4、Bcl-2及Bax蛋白表达水平, Bcl-2/Bax比值,细胞增殖率和细胞周期的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3种细胞DPC4、Bcl-2及Bax蛋白的表达 见表1。

表1 3种细胞DPC 4、Bcl-2及Bax蛋白测定结果(n=3)

2.2 3种细胞增殖率和细胞周期测定结果 见表2、3。

表2 3种细胞增殖率检测结果(n=5)

表3 3种细胞细胞周期检测结果(n=3) %

3 讨论

以往的研究[5]表明 DPC4对胰腺癌细胞株、乳癌细胞株有明显的促凋亡作用。Dai等[5]将野生型DPC4基因导入人乳癌细胞后,细胞出现 G1期停滞和凋亡,进一步研究发现Smad4核移位直接诱导了细胞凋亡,其诱导凋亡作用不依赖 P53和 RB蛋白[5]。袁晟光等[2]将 DPC4基因导入胰腺癌细胞株HS766中,细胞亦发生凋亡,同时发现 DPC4基因只有在TGF-B信号传递系统的其他成员共同作用下才能诱导细胞凋亡。Ke等[6]证实DPC4基因参与了小细胞肺癌的发生,并通过调节凋亡基因Bcl-/ Bax之间的平衡诱导细胞凋亡。

作者将DPC4基因成功转染入JF305细胞,观察DPC4、Bax及Bcl-2蛋白的表达,并观察转染后细胞周期和细胞增殖力的变化。结果显示,胰腺癌JF305细胞株转染DPC4基因后,细胞生长缓慢,细胞周期停滞在G1期,转染后JF305细胞中Bcl-2的表达明显下降,Bax蛋白的表达明显增强,Bcl-2/Bax比值下降,表明转染DPC4的JF305细胞凋亡作用增强。由此推测DPC4通过调整抑制凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax的表达,诱导细胞凋亡,从而抑制了肿瘤的生长,但具体机制需进一步实验证实。

[1]Zawel L,Dai JL,Buckhaults P,et al.Human Smad3 and Smad4 are sequence-specific transcription activators[J]. Mol Cell,1998,1(4):611

[2]袁晟光,冯燮林,田聆,等.Smad4对胰腺癌细胞HS766T生长抑制的研究[J].第三军医大学学报,2003,25(9): 795

[3]王举,窦忠霞,韩喜春,等.大肠癌及癌旁组织中抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax的表达及意义[J].中国普外基础与临床杂志,2002,9(4):252

[4]刘一平,邱兆华,张映辉,等.SMAD 4蛋白对胰腺癌细胞促凋亡作用的研究[J].生物技术通讯,2000,11(3):85

[5]Dai JL,Bansal RK,Kern SE.G1 cell cycle arrest and apoptosis induction by nuclear Smad4/DPC4:phenotypes reversed by a tumorigenic mutation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(4):1427

[6]Ke Z,Zhang X,Ma L,et al.Deleted in pancreatic carcinoma locus4/Smad 4 participates in the regulation of apoptosis by affecting the Bcl-2/Bax banlance in non-small cell lung cancer[J].Hum Pathol,2008,39(10):1438