导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型中的应用

张 艺

郑州市中心医院检验科郑州 450007

人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种小分子双链DNA病毒,可致人类皮肤和黏膜异常增生,是诱发女性宫颈癌及生殖器病变的主要病源。在超过 95%的早期浸润和浸润性宫颈癌中,至少发现20种致癌 HPV亚型,根据其致病性差异可分为高危型和低危型[1],其中高危型 HPV与宫颈癌和宫颈上皮瘤变有关,低危型HPV与外生殖器尖锐湿疣等良性病变有关[2]。作者对郑州市中心医院就诊的354例宫颈糜烂患者进行HPV基因分型检测,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择 2008年 10月至 2010年 8月郑州市中心医院妇科收治的宫颈糜烂患者共 354例,年龄 20～63岁。标本采集:将专用宫颈刷置于宫颈口,轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转 5圈,取出宫颈刷,折断刷头置入加有专用细胞保存液的取样管中,拧紧瓶盖。4℃保存,2周内检测。

1.2 仪器与试剂 实时荧光定量PCR扩增仪(美国ABI 7300),HybriMax医用核酸分子快速杂分仪(中国凯普生物科技有限公司)。HPV DNA抽提试剂盒、HPV基因分型检测试剂盒(中国凯普生物科技有限公司),可检出 21种亚型,包括高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和 68),低危型(6、11、42、43和 44)及3种中国人群常见高危型(53、66和CP8304)。

1.3 DNA提取及HPV各基因型检测方法 取宫颈细胞保存液0.5mL,14 000 r/min离心5 min,弃上清液,按HPV DNA抽提试剂盒提取DNA。PCR扩增:反应总体系 25μL,每次实验设一个阴性对照及阳性对照。PCR反应条件为20℃10 min;95℃9min;循环40次(95℃20 s,55℃30 s,72℃30 s); 72℃延伸5 min。导流杂交:①取PCR扩增产物20 μL,95℃加热5 min,冰水浴2m in。②杂交孔内加入1m L预热至45℃的杂交液。③把步骤①制备的已变性DNA样品溶液加入0.5 mL预热至45℃的杂交液,混匀,加在芯片薄膜上温育10 min后开泵进行导流杂交。④45℃条件下,预热 45℃杂交液冲洗膜 3次。用凯普专用阅读仪对结果进行判读。每张芯片上均设有PCR反应质控点和杂交显色质控点各一个。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0进行分析,对不同年龄组HPV感染人数行χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结果

354例宫颈糜烂患者中,HPV阳性率为37.8% (134/354),21种HPV亚型均被检出,共检测出230例次。HPV各基因分型检出例次见表 1。不同年龄组HPV的感染情况比较结果见表2。

表1 HPV各基因分型检出例次比较(n=354)

表2 不同年龄组HPV的感染情况比较

3 讨论

在HPV的基因型检测中,目前主要采用实时荧光PCR法及杂交捕获法。导流杂交技术将基因PCR扩增技术及基因芯片技术集于一身,最大限度地发挥了上述技术的特点,有较高的敏感度和特异性,可检测 21种HPV亚型,而且包含了3个中国人常见的高危亚型,增加了HPV各亚型尤其是高危型HPV亚型感染的检出率及不同亚型复合感染的检出率,并可在数小时内获得结果,能为患者和临床提供非常有价值的诊疗依据,是目前较好的HPV分型检测方法[3]。

据WHO研究[4]统计,曾感染HPV的人数在性活跃期男女中的比率为 40%,它们广泛存在于成年人族群中,一般 HPV感染者无临床症状,大部分感染了HPV的妇女将会发展为轻度宫颈损伤,而大多数轻度损伤都可以自行恢复,只有持续存在的高危感染才可能引起癌前病变。作者在 354例标本中共检出134例HPV感染者,HPV感染率为37.8%;21种基因型均被检出。高危型主要是 16、18型,与文献[5]结果一致。从表2可看出20～岁年龄段HPV感染率较高,其次为 31～岁年龄组,这可能和这个年龄段性活跃有关。单一低危型感染患宫颈癌或高度病变的风险很低,而高危型感染、持续感染患宫颈癌或高度病变的风险增大[6]。因此,准确检测HPV感染及其分型对宫颈癌筛查、早期确诊及预后判断等具有重要的临床意义。

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