食管鳞状细胞癌组织中 Pim-3和微小染色体7蛋白的表达

别良玉,张伟杰,任川川,王 琳,孙 桢,杜雅冰,王 生,樊青霞#

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州 450052 2)郑州大学肿瘤中心郑州 450052 3)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州 450052 4)许昌市中心医院肿瘤科许昌 461000

#通讯作者,女,1952年6月生,教授,研究方向:食管癌内科综合治疗,E-mail:fqx2243@yahoo.com.cn

Pim激酶是一个与哺乳动物蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶密切相关的家族[1],研究[2]发现 Pim激酶家族能使促凋亡分子Bad发生磷酸化而失活,同时使抗凋亡家族Bcl-XL、Bcl-2的表达增加,导致细胞恶性增殖。Pim家族有3个成员,Pim-1、Pim-2和Pim-3,目前Pim-3在肿瘤发生中的研究主要集中在尤文肉瘤、肝癌、胰腺癌、结肠癌及胃癌等。微小染色体(minichromosomemantenance,MCM)是影响染色体有丝分裂稳定性的主要基因,其编码的MCM蛋白家族与DNA复制的启动密切相关。MCM7为MCM的关键成员,在控制DNA复制的起始过程中起关键作用[3]。作者采用免疫组化SP法检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中Pim-3和MCM7蛋白的表达情况,并结合临床病理特征,探讨二者在ESCC发生、发展中的作用及相互关系。

1 材料与方法

1.1 标本 收集2008年 11月至2009年1月安阳市肿瘤医院手术切除的新鲜食管癌标本 77例。77例中男51例,女26例,年龄44～78岁,中位年龄 61岁,全部病例经病理证实均为鳞状细胞癌。肿瘤大小1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm～8.0 cm×8.0 cm× 2.0 cm;发生部位:胸上段12例,胸中段51例,胸下段14例;大体病理形态:溃疡型 33例,髓质型 34例,缩窄型7例,蕈伞型3例;组织学分级:高中分化癌 41例,低分化癌 36例;肿瘤侵及外膜 56例,未侵及外膜 21例;有淋巴结转移 39例,无淋巴结转移38例。按国际抗癌联盟(UICC)与美国癌症联合会(AJCC)2009年联合出版的食管癌国际TNM分期标准(第 7版)[4],Ⅰ、Ⅱ期 48例,Ⅲ、Ⅳ期 29例。另取郑州大学第一附属医院病理科 2009年 7月至2009年 10月存档的距癌组织边缘1.0～1.5 cm处癌旁中重度不典型增生组织 70例,距癌组织边缘 ＞5 cm处正常食管黏膜组织 46例。所有患者术前均未行放、化疗或其他针对肿瘤的治疗,术后病理检测其切缘均为阴性,所有患者临床病理资料均完整。

1.2 主要试剂 兔抗人 Pim-3多克隆抗体(ab71321,Abcam公司)和鼠抗人MCM 7单克隆抗体(SC-9966,Santa Cruz公司)。DAB显色剂和SP-9000免疫组化检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 Pim-3和MCM 7蛋白表达的免疫组化检测将获得的全部标本经体积分数为 10%福尔马林溶液固定,石蜡包埋,4μm厚连续切片。按试剂盒说明书的步骤操作,一抗工作浓度均为 1∶100。用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。采用双盲法进行结果判定,每张切片由 2名病理科医师分别判断,二者结果不一致时重新判断。①Pim-3蛋白阳性细胞表现为胞质棕黄色着色,每张切片选取 5个具有代表性的高倍视野,计数500个细胞中的阳性细胞数。依据文献[5]标准,按阳性细胞所占比例进行分级:＜25%为 -,25%～为+,51%～为■,＞75%为■。②MCM7蛋白阳性细胞表现为胞核棕黄、棕褐色颗粒状着色。按染色强度及阳性细胞数量进行分级:染色与背景相似者为 0分,着色浅、略高于背景者为 1分,中度着色、明显高于背景者为 2分,强染、着深棕色者为 3分;阳性细胞数百分率 ＜10%为 0分,10%～为 1分, 51%～为 2分,＞75%为 3分。两项评分相加:0～1分为 -,2分为 +为,3～4分为■,≥5分为■。

1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0进行分析,3种食管组织、不同临床病理特征ESCC组织间Pim-3和MCM7蛋白表达水平的比较采用秩和检验;对ESCC组织中Pim-3和MCM 7蛋白的表达进行Spearman秩相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3种组织中Pim-3和MCM 7蛋白的表达 见图1和表1。

图1 不同食管组织中Pim-3(A)和MCM 7(B)蛋白的表达(SP,×400)

表1 ESCC、癌旁不典型增生和正常食管组织中Pim-3和MCM 7蛋白的表达

2.2 Pim-3和MCM 7蛋白的表达与ESCC患者临 床病理特征的关系 见表2。

表2 ESCC组织中Pim-3和MCM 7蛋白的表达与临床病理特征的关系

2.3 ESCC组织中Pim-3和MCM 7蛋白表达的相关性 见表3。

表3 ESCC组织中Pim-3与M CM 7蛋白表达的相关性

3 讨论

中国是世界上食管癌发病率和病死率最高的国家,全世界每年新诊断的 30万食管癌患者中半数以上是在中国(16.72万)[6]。河南省,特别是河南北部的林州市(原林县)、安阳、辉县等地是食管癌发病率和病死率最高的地区[7]。早期诊断对食管癌的预后意义重大,然而目前尚无特异性的肿瘤标志物,因此迫切需要寻找特异性的食管癌分子指标。

Fujii等[8]发现,Pim-3蛋白在高分化肝细胞癌细胞胞质呈弱阳性表达,在肝脏再生胆管中亦有表达,而在正常肝组织中不表达。Li等[9]发现 Pim-3蛋白在人胰腺癌组织中异常表达,但在正常胰腺组织中不表达。Popivanova等[2]在人结肠癌的研究中发现Pim-3蛋白在高中分化的结肠癌组织中有表达,而在低分化结肠癌组织中无表达。

作者的研究结果显示ESCC组织中Pim-3蛋白的表达水平高于癌旁中重度不典型增生组织及正常食管黏膜组织,Ⅲ、Ⅳ期ESCC组织中的表达水平高于Ⅰ、Ⅱ期,有淋巴结转移组中的表达水平高于无淋巴结转移组。推测Pim-3的异常表达在ESCC的发生过程中有一定作用,可能成为判断ESCC淋巴结转移生物学行为的一个指标。Zheng等[10]研究发现原发性胃癌组织中Pim-3蛋白过度表达的患者生存期明显缩短,认为 Pim-3可能是胃癌一个独立的预后因子。作者的随访研究尚在进行中。

MCM家族被认为是启动DNA复制的关键因子[3]。MCM蛋白的表达在 G1/S转换达峰值,当细胞进入G0期和分化、衰老时,MCM表达水平下降甚至检测不到。因而MCM蛋白已被提出作为一个新的生物学标记用来检测“伴有生长潜能”的 G1期细胞[11]。

作者的研究结果显示,在正常食管黏膜上皮中MCM7蛋白表达多局限在基底层,表明基底层及其临近细胞具有一定的分裂增殖能力。在由正常食管黏膜向中重度不典型增生、癌变发展的过程中, MCM7蛋白表达逐渐升高,说明随着食管黏膜由正常向癌转变,越来越多的细胞进入增殖周期。MCM7蛋白的表达还与食管癌的分化程度和有无外膜浸润有关,这与 Ren等[12]在前列腺癌、任占平等[13]在乳癌组织中的研究结果一致。推测可能与MCM7蛋白高表达导致 G1期阻滞、S期复制起始准许调控精确功能的丧失,使得受损的食管鳞状上皮细胞在DNA损伤的状况下绕过完整的细胞周期有关。MCM7表达水平与细胞的增殖程度有关,可以体现肿瘤的恶性程度,提示可以进一步研究MCM 7与ESCC预后的关系。

该研究结果还显示ESCC组织中Pim-3与MCM7蛋白的表达无明显相关性,其真正的原因有待进一步研究。

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