顺铂对TRAIL诱导EC1细胞凋亡的增敏效应*

江亚南,马俊芬,黄幼田,李 沛,李芳芳,杨 浩,董子明#

1)郑州大学基础医学院病理生理学教研室郑州 450001 2)郑州大学基础医学院临床医学系郑州 450001

#通讯作者,男,1954年4月生,博士,教授,研究方向:食管癌DNA聚合酶β与癌变机制,E-mail:dongzm@zzu.edu.cn

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中凋亡诱导成员中的一员,已被认为是肿瘤治疗中新的生物制剂[1]。TRAIL主要通过诱导对其敏感的肿瘤细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用,对正常细胞包括肝细胞和骨髓细胞几乎无毒性。不同组织类型的癌细胞对TRAIL的敏感性不同,有研究[2]表明联合化疗或放疗均可以明显提高TRAIL对不敏感肿瘤细胞的凋亡诱导作用。该研究中作者通过TRAIL或顺铂(cDDP)单独以及二者联合应用,观察cDDP对TRAIL诱导食管癌EC1细胞凋亡的增敏作用,为TRAIL用于食管癌的生物治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 TRAIL购自美国R＆D公司,cDDP由山东齐鲁制药厂生产,MTT购自美国Sigma公司,小牛血清购自天津TBD公司,RPMI 1640培养粉购自美国Gibco公司,二甲基亚砜购自美国Sigma公司。AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒购自宝赛生物公司,细胞周期试剂盒购自美国BD公司,碘化吡啶购自美国Sigma公司。EC1细胞系由香港大学曹世华教授惠赠。

1.2 细胞培养 EC1细胞在含有体积分数10%的胎牛血清,100 U/m L青霉素,100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中,于37℃,体积分数为5%CO2孵箱中培养。0.2 g/L乙二胺四乙酸和0.5 g/L胰蛋白酶混合液消化、传代、备用。

1.3 不同质量浓度的TRAIL或cDDP作用不同时间对EC1细胞增殖的影响 采用MTT法。取处于对数生长期的细胞,调整细胞浓度为 4×104m L-1,接种于 96孔板。分别加入终质量浓度为 0、10、50、100、500和 1 000μg/L的TRAIL及0、1.0、2.0、4.0、10.0和20.0 mg/L的cDDP,均设5个复孔。分别作用24、48和72 h后,每孔加入MTT 20μL,继续培养4 h后去上清,每孔加入 150μL二甲基亚砜,振荡10min,在酶标仪上以空白对照孔调零,570 nm处读取吸光度值(A)。细胞增殖率=(实验孔平均A值/对照孔平均A值)×100%。

1.4 TRAIL与cDDP单用或联用对EC1细胞凋亡的影响 取5×104个EC1细胞接种于培养瓶,以IC50cDDP(10.0mg/L)和治疗剂量TRAIL(100μg/ L)单独或联合作用于EC1细胞,48 h后收集细胞,同时设未加药物的空白对照组。PBS液洗涤 2遍,再用体积分数70%乙醇固定,4℃过夜,按AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒步骤操作,上流式细胞仪检测细胞凋亡,分析细胞凋亡率。

1.5 TRAIL和cDDP单用或联用对EC1细胞周期的影响 取EC1细胞,同1.4项分组处理后,用0.5 g/L胰蛋白酶消化,2 000 r/m in离心8 min,弃上清;用PBS洗2遍,离心后弃上清,加入体积分数70%冰乙醇固定,4℃过夜;上机前,2 000 r/ min离心8min,弃去乙醇,PBS洗2遍;加入1 mL PBS制成细胞悬液,按细胞周期试剂盒步骤操作,上流式细胞仪检测细胞周期,每个样本检测 10 000个细胞。

1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0进行分析。应用 3×5析因设计的方差分析比较不同质量浓度的TRAIL与cDDP作用不同时间对EC1细胞增殖的影响,应用2×2析因设计的方差分析比较TRAIL或cDDP单用及联用对EC1细胞凋亡和细胞周期的影响,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同质量浓度TRA IL或cDDP作用不同时间对EC1细胞增殖的影响 见表 1、2。

表1 不同质量浓度TRAIL作用不同时间对EC 1细胞增殖的影响(n=5) %

表2 不同质量浓度cDDP作用不同时间对EC 1细胞增殖的影响(n=5) %

2.2 TRAIL与cDDP单用或联用对EC1细胞凋亡率的影响 见表3。

表3 TRAIL与cDDP单用或联用对EC 1细胞凋亡率的影响(n=5) %

2.3 TRA IL和cDDP单用或联用对EC1细胞周期的影响 见表4～6。

表4 TRA IL和cDDP单用或联用对EC 1细胞G0/G1期的影响(n=5) %

表5 TRA IL和cDDP单用或联用对EC 1细胞G2/M期的影响(n=5) %

表6 TRA IL和cDDP单用或联用对EC 1细胞S期的影响(n=5) %

3 讨论

应用细胞因子对肿瘤进行生物学治疗是近年来国内外学者研究的一个重要方向。TRAIL可以特异地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞几乎没有作用,但是多种肿瘤细胞对其并不敏感[3-5]。该实验结果显示EC1细胞的增殖不随TRAIL作用时间或质量浓度的增加而改变,表明EC1对TRAIL并不敏感。如何增加食管癌EC1细胞对TRAIL的敏感性是TRAIL更好地应用于食管癌临床治疗的关键问题。

有文献[6-7]表明临床常用化疗药物 cDDP和TRAIL联用可以增加多种肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。cDDP是目前食管癌化疗中的常用药物,具有广泛的抗瘤谱。在大量或长期应用后,常引起耳肾毒性及产生耐药性而导致化疗失败[8-9]。该研究结果示cDDP对EC1细胞的增殖有抑制作用,且随着cDDP作用时间和质量浓度的增加而增强。作者将IC50cDDP和治疗剂量的TRAIL联合作用于EC1细胞48 h,结果显示单用TRAIL对EC1细胞的凋亡影响不大,但是与cDDP联合作用后,EC1细胞的凋亡率升高,表明cDDP对TRAIL诱导EC1细胞凋亡有增敏效应,为TRAIL用于食管癌的临床治疗提供了实验依据。

细胞周期被阻滞于不同检测点的意义不同:细胞阻滞在G1期检查点,可防止DNA受损的细胞进入S期复制;阻滞在S期检查点,可防止DNA复制不完全细胞进入 G2/M期;阻滞在G2期检查点,防止在 M期进行异常分裂[9]。该研究结果显示单用cDDP或TRAIL并不明显影响EC1细胞周期,而二者联合可将EC1细胞阻滞于G2/M期。具体机制有待于进一步研究。

[1]Jin H,Yang R,Fong S,et al.Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand cooperates with chemotherapy to inhibit orthotopic lung tumor grow th and improve survival[J].Cancer Res,2004,64(14):4900

[2]AshkenaziA,PaiRC,Fong S,etal.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].JClin Invest,1999,104(2):155

[3]Vignati S,Codegoni A,Polato F,et al.Trail activity in human ovarian cancer cells:potentiation of the action of cytotoxic drugs[J].Eur JCancer,2002,38(1):177

[4]Pan G,O'Rourke K,Chinnaiyan AM,et al.The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL[J].Science,1997,276 (5309):111

[5]徐玉生,许建中,苗金红,等.顺铂、TRAIL单独或联合应用对横纹肌肉瘤细胞生长的影响[J].郑州大学学报:医学版,2006,41(4):691

[6]Wiezorek J,Holland P,Graves J.Death receptor agonists as a targeted therapy for cancer[J].Clin Cancer Res, 2010,16(6):1701

[7]Mahmood Z,Shukla Y.Death recep tors:targets for cancer therapy[J].Exp Cell Res,2010,316(6):887

[8]郝秀轻,张林西,孙黎,等.NS-398联合顺铂对Eca-109细胞增殖及凋亡的影响[J].郑州大学学报:医学版,2010,45(5):713

[9]Kermp ler A,Deckbar D,Jeggop A,et al.An imperfect G2M checkpoint contributes to chromosome instability following irradiation of S and G2 phase cells[J].Cell Cycle, 2007,6(14):1682