多维数据分析法同时分辨3种荧光光谱重叠的氨基酸

薛永林，任守信，张雁冰，高 玲*

(内蒙古大学化学化工学院，内蒙古 呼和浩特 010021)

多维数据分析法同时分辨3种荧光光谱重叠的氨基酸

薛永林，任守信，张雁冰，高 玲*

(内蒙古大学化学化工学院，内蒙古 呼和浩特 010021)

研究正交信号校正(orthogonal signal correction，OSC)-小波包变换(wavelet packet transform，WPT)-偏最小二乘法(partial least squares，PLS)法用于不经化学分离直接解析荧光光谱严重重叠的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸混合体系。本实验POSCWPTPLS程序执行相关计算，并将3种化学计量学方法(OSC-WPT-PLS、WPT-PLS和PLS)进行比较。3种氨基酸的总体相对预测标准偏差分别为2.80%、4.35%和5.14%，结果表明：OSC-WPT-PLS法优于WPT-PLS法和PLS法，将该法用于测定自来水及内蒙产的金骆驼酒和河套老窖酒中的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的含量及其回收率分别为96.9%～103.2%、94.1%～105.4%、95.3%～107.8%，取得良好效果。

多维数据分析；荧光光度法；同时测定；色氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸

化学计量学是化学、数学、统计学与计算机科学的接口，在试验设计、数据处理、信号解析、化学分类决策及预报方面有着重要的作用。在食品科学中引入化学计量学可以较好消除背景干扰，分辨食品检测重叠波谱，揭示波谱数据中隐含的信息如结构、种类、性状等[1-7]。

氨基酸是蛋白质的基本结构单位，是动物体合成蛋白质的原料来源，也是人体中必不可少的营养成分之一，属食品、饲料的营养成分，在医学上具有防病治病的作用，也可作为营养型化妆品的有效成分及合成药物、表面活性剂、其他工业产品的化工原料。因此，对氨基酸的分析检测具有重要意义。荧光分析法具有快速、简便、灵敏度高等特点，在痕量分析中应用广泛[8]。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[9-10]是仅有3种具有内源荧光的天然氨基酸，但是3者的荧光激发、发射光谱均严重重叠，在荧光检测中易互相干扰，这就为其多组分的同时测定造成了困难。同一样品中多种共存组分的同时测定是实际生产、生活中常常面临的问题，也是分析化学要解决的热点问题[11]，因此，化学计量学的优点脱颖而出，它有利于提高信噪比，增加测量精密度，改善分析选择性，拓宽应用范围。本实验将OSC、WPT和PLS方法相结合建立OSC-WPT-PLS化学计量学方法，对荧光光谱严重重叠的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸混合物进行同时测定。

1 材料与方法

1.1 材料﹑试剂与仪器

金骆驼酒 内蒙古察右前期金骆驼酒业股份有限公司；河套酒 内蒙古巴盟河套酒业集团；L-色氨酸 北京市东环联合化工厂；L-酪氨酸 国药集团化学试剂有限公司；L-苯丙氨酸 天津市光复精细化工研究所。

3种氨基酸用二次蒸馏水分别配成1.27×10-3、1.89 ×10-2、1.40×10-2mol/L储备液，工作液根据所需适当稀释制备；缓冲液：NaH2PO4-NaOH，pH7.2；所用其他试剂除注明外均为分析纯；所用水为二次蒸馏水。

RF-5301PC 日本Shimadzu仪器公司；pHS-3B型精密pH计 上海雷磁仪器厂；奔腾IV型计算机 中国联想公司。

1.2 方法

1.2.1 OSC-WPT-PLS法原理

该方法把能有效消除荧光光谱矩阵中与浓度无关的结构噪音的正交信号校正法(orthogonal signal correction，OSC)[12]和能够灵活实现域值转换从而消除测量信号噪音的小波包变换法(wavelet packet transform，WPT)[13-16]与能有效提高回归性能的经典偏最小二乘法(partial l east squares，PLS)[17]有机结合，建立OSC-WPT-PLS方法[18]。

该法是结合OSC、WPT和PLS3种方法优点构成的一种推广的PLS方法。将由实验数据构筑的训练集矩阵D和预测集矩阵Du经平均中心化后，用OSC方法进行数据前处理，滤除结构噪音。为确保最佳的校正能力，最佳OSC因子数需经实验选择。OSC校正后的数据矩阵，经快速小波包变换转入小波包域，通过最佳小波包基和除噪阈值的选择滤除噪音，选择处理后的小波包系数经小波包逆变化转入原域。为确保小波包前处理能力，最佳小波包函数和分解水平需经实验优化获得。原始数据经OSC和WPT处理后进行PLS回归。本法可同时解决信号校正、数据压缩、消除噪音和共线及回归等问题。根据上述原理，编制名为POSCWPTPLS程序，执行相关计算。

1.2.2 正交试验设计

以L16(45)正交表进行正交试验设计。加入16份不同浓度的3种氨基酸标准液于25.00mL容量瓶中，再加入3.00mL NaH2PO4-NaOH缓冲液(pH7.2)，然后用二次蒸馏水稀释至刻度摇匀。用1cm石英比色皿，激发波长265nm，在260.0～400.0nm波长范围，以0.2nm波长间隔，狭缝10nm，灵敏度为低的条件下测量其发射光谱的荧光强度。并以此数据构筑训练集荧光强度矩阵D。以L9(33)正交表进行正交设计，将9个合成试样溶液按上述方法建立预测集矩阵Du。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱

3种化合物的激发、发射荧光光谱分别如图1a、b所示。从图1可以看出3种化合物的激发、发射光谱存在较严重的重叠，这使得用传统的峰值定量进行选择性分析非常困难。

图1 3种氨基酸的激发光谱和发射光谱图Fig.1 Excitation and emission spectra of phenylalanine, tryptophan and tyrosine

2.2 混合物体系荧光波长的选择

激发、发射波长的选择是多组分混合物荧光分析的一个重要因素。理想的波长范围，是能够尽可能大的保证不同组分的灵敏度，同时又要避免光谱干扰，比如瑞利散射的干扰等。从图1可见，其3个组分荧光激发、发射光谱最大荧光强度分别在257/284nm(苯丙氨酸)、275/354nm(色氨酸)、274/304nm(酪氨酸)，3者的最大激发波长差别较小，而且3种物质的斯托克斯位移都不大，所以选择激发波长和发射波长范围在这个体系中显得尤为重要。分别在250～290nm之间试验不同的激发波长，对本体系荧光强度的影响，结果显示当激发波长为265nm时，进行发射光谱扫描效果最好。

2.3 不同pH值对荧光强度的影响

酸度是影响荧光强度的重要因素，在pH6.5～10.5范围内进行多次试验，如图3所示，pH值的变化对色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的荧光强度均影响较大。在pH6.5～7.5时，3种氨基酸均具有较强的荧光信号。综合考虑，最终选取3.0mL、pH7.2 NaH2PO4-NaOH缓冲液来控制体系的酸度。

图2 溶液酸度对荧光强度的影响Fig.2 Effect of solution acidity on fluorescence intensities of tyrosine, tryptophan and phenylalanine

2.4 OSC-WPT-PLS方法

参数选择是本法的关键步骤。本实验选择小波函数、小波分解水平(L)、OSC因子数和PLS因子数，分别对这4种参数进行优化试验，结果见表1、2。以实验数据矩阵D和Du作为原始数据，并比较所有组分的预测标准偏差(standard error of prediction，SEP)和相对预测标准偏差(relative standard error of prediction，RSEP)。不同的小波函数具有不同的除噪效果，为获取最佳的除噪效果，进行Daubechies 由2～24，Symmlet由4～10和Coiflet由1～5的优化试验，当选小波函数Daubechies为4时，所有组分的RSEP最小。小波分解水平L为1～7实验结果显示，当L=2时所有组分的RSEP最小。同时对OSC因子数进行试验，结果显示OSC因子数选为3时RSEP最小。最终实验选定的最佳参数为小波函数Daubechies =4，L=2，OSC因子数=3和PLS因子数=3。

表1 小波包分解水平和其他参数的最佳化Table 1 Optimization of wavelet packet decomposition levels and other parameters

表2 小波函数的最佳化Table 2 Optimization of wavelet functions

表3 训练集的组成Table 3 Composition of training set

按正交表L16(45)正交设计，配制16个色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的混合溶液样品，其浓度组成见表3。在260.0～400.0nm范围每隔0.2nm测定其荧光强度，以此数据构筑训练集荧光强度矩阵D，9个合成未知样以同样方式测量荧光强度，构筑训练集荧光强度矩阵Du。经OSC-WPT-PLS方法计算合成样中色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的浓度和回收率，结果见表4。所有化合物的SEP和 RSEP分别为0.214mol/L和2.80%，表明本法成功。

表4 合成未知样的实际浓度﹑测定浓度及回收率Table 4 Actual concentrations, determined concentrations and recovery rates of tyrosine, tryptophan and phenylalanine in synthetic unknown samples

2.5 OSC-WPT-PLS、WPT-PLS 和 PLS方法的比较

选用一组合成未知样分别用OSC-WPT-PLS、WPTPLS和PLS 3种方法进行实验。3种方法的比较结果见表5，由表5可见，所有化合物的总体RSEP分别为2.80%、4.35%和5.14%。结果表明3种方法均成功，且OSC-WPTPLS法的总体相对预测标准偏差最小，所以此法优于其他两种方法。

表5 3种方法测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸体系的总体预测标准偏差和总体相对预测标准偏差Table 5 SEP and RSEP of tryptophan, tyrosine and phenylalanine determined by three methods

2.6 线性范围及检出限

对3种组分分别测定其线性范围，结果表明，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸分别在0～1.78×10-5、0～3.78×10-5、0～2.52×10-3mol/L范围内，与荧光信号呈良好的线性关系。对空白溶液进行11次平行测定，以空白溶液荧光强度的3倍标准偏差所对应的浓度计算方法的检出限。表6分别为3种氨基酸的线性关系以及检出限测定结果。

表6 线性方程及检出限Table 6 Linear equations and detection limits of tyrosine, tryptophan and phenylalanine

2.7 精密度

配制色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸浓度分别为5.08× 10-6、7.56×10-6、5.60×10-4mol/L的单一溶液，在相同仪器条件下用本方法进行扫描平行测定11次荧光强度，得到色氨酸﹑酪氨酸﹑苯丙氨酸的相对标准偏差分别为0.55%、0.73%、1.4%。

2.8 实际样品的测定

采用加标回收法，考察不同浓度比的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸在实际样中的回收率。分别取3.0mL自来水﹑金骆驼酒和河套老窖酒各3份，分别加入3.0mL NaH2PO4-NaOH缓冲液，再加入不同浓度比的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸溶液，用二次蒸馏水稀至刻度，然后以激发波长为265nm进行扫描发射光谱，用OSCWPT-PLS方法进行计算，结果见表7。

表7 实际样品的浓度及回收率Table 7 Actual concentrations, determined concentrations and recovery rates of tyrosine, tryptophan and phenylalanine in real samples

2.9 干扰实验

实验表明，常见无机离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、SO42-、CO32-、PO43-、NO3-、Cl-等和赖氨酸﹑苏氨酸﹑蛋氨酸﹑组氨酸﹑半胱氨酸都在相对误差±5%范围内，不影响测定。

3 结 论

应用OSC-WPT-PLS 法对荧光激发，发射光谱严重重叠的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸3组分混合体系进行同时测定，并与WPT-PLS 和 PLS 2种方法进行比较。3种方法(OSC-WPT-PLS，WPT-PLS 和PLS)的RSEP 分别为2.80%、4.35% 和5.14%。该法用于测定自来水及内蒙产的金骆驼酒和河套老窖酒中3种氨基酸含量的测定，其回收率分别为96.9%～103.2%、94.1%～105.4%和95.3%～107.8%。

[1]高玲, 任守信. 小波包变换潜变量回归同时测定锰锌钴[J]. 冶金分析, 2003, 23(3)∶ 1-5.

[2]HAO Yong, CAI Wensheng, SHAO Xueguang. A strategy for enhancing the quantitative determination ability of the diffuse reflectance nearinfrared spectroscopy[J]. Spectrochim Acta Part A, 2009, 72(1)∶ 115-119.

[3]NI Yongnian, WANG Yong , KOKOT S. Simultaneous kinetic spectrophotometric analysis of five synthetic food colorants with the aid of chemometrics[J]. Talanta, 2009, 78(2)∶ 432-441.

[4]GAO Ling, REN Shouxin. Simultaneous spectrophotometric determination of four metals by two kinds of partial least squares method[J]. Spectrochim Acta∶ A, 2005, 61(13/14)∶ 3013-3019.

[5]何锡文, 唐志新, 杨万龙, 等. 优化目标转换因子法[J]. 分析化学, 1994, 22(3)∶ 218-222.

[6]倪永年, 黄春芳. 化学计量学在食品分析中的应用与进展[J]. 食品科学, 2003, 24(2)∶ 154-158.

[7]陆晓华, 施文赵. 化学计量学[J]. 自然杂志, 1992, 15(4)∶ 286-289.

[8]陈国珍. 荧光分析法[M]. 北京∶ 科学出版社, 1990∶ 10-15.

[9]张为, 曹玉珍, 刘振宇, 等. 平行因子算法用于酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的同时定性与定量测定[J]. 化学通报, 2002(6)∶ 48-421.

[10]张晶玉, 杨金夫, 任英, 等. Kalman滤波荧光光度法同时测定酪氨酸和苯丙氨酸[J]. 光谱学与光谱分析, 1994, 14(5)∶ 5-8.

[11]梁逸曾. 白灰黑复杂多组分分析体系及其化学计量学算法[M]. 长沙∶湖南科技出版社, 1996.

[12]WESTERHUIS J A, DE JONG S, SMILDE A G. Direct orthogonal signal correction[J]. Chemometr Intell Lab Syst, 2001, 56(18)∶13-25.

[13]REN Shouxin, GAO Ling. Simultaneous quantitative analysis of overlapping spectrophotometric signals using wavelet multiresolution analysis and partial least squares[J]. Talanta, 2000, 50(6)∶ 1163-1173.

[14]COIFMAN R R, WICKERHAUSER M V. Entropy-based algorithms for best basis selection[J]. IEEE Trans Inform Theory, 1992, 38(2)∶713-718.

[15]REN Shouxin, GAO Ling. Resolve of overlapping voltammetric signals in using a wavelet packet transform based Elman recurrent neural network[J]. Electroanal Chem, 2006, 586(6)∶ 23-30.

[16]GAO Ling, REN Shouxin. Combining orthogonal signal correction and wavelet packet transform with radial basis function neural networks for multicomponent determination[J]. Chemometr Intell Lab Syst, 2001, 100(1)∶ 57-65.

[17]NAVAL N A, BLANC R, Del OLMO M, et al. Simultaneous determination of naproxen , salicylic acid and acetylsalicylic acid by spectrofluorimetry using partial least-squares (PLS) multivariate calibration [J]. Talanta, 1999, 48(2)∶ 469-475.

[18]薛永林, 任守信, 赵志超, 等. 化学计量学方法同时测定铁、铝和铍[J]. 分析科学学报, 2010, 26(5)∶ 543-546.

Simultaneous Detection of 3 Amino Acids with Overlapped Fluorescent Spectra by Multi-dimensional Data Analysis

XUE Yong-lin，REN Shou-xin，ZHANG Yan-bing，GAO Ling*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China)

An orthogonal signal correction-wavelet packet transform-partial least squares (OSC-WPT-PLS) method was proposed for simultaneous detection of tryptophan, tyrosine and phenylalanine with overlapped fluorescent spectra. A program (POSCWPTPLS) was designed to execute relevant calculations and three chemometric methods (OSC-WPT-PLS, WPTPLS and PLS) were compared in this study. The relative standard errors of prediction (RSEP) were achieved for all components by using OSC-WPT-PLS, WPT-PLS and PLS were 2.80%, 4.35% and 5.14%, respectively. The OSC-WPT-PLS method revealed the best detection efficiency among three methods, which could be successfully applied to determine the contents of tryptophan, tyrosine and phenylalanine in water, Gold-Camel wine and Hetao wine made in Inner Mongolia with a recovery rate of respectively 96.9%-103.2%, 94.1%-105.4% and 95.3%-107.8%.

multi-dimensional data analysis；fluorespectrophotometry；simultaneous determination；tryptophan；tyrosine；phenylalanine

O657.3

A

1002-6630(2011)16-0290-05

2010-11-19

国家自然科学基金地区项目(21067006；0762003)；内蒙古自然科学基金项目(2009MS0209)

薛永林(1982—)，女，硕士研究生，主要从事分析化学及化学计量学研究。E-mail：xuerui7451@163.com

*通信作者：高玲(1957—)，女，高级工程师，主要从事分析化学及化学计量学研究。E-mail：lingyuxi@hotmail.com