落叶松杂种与亲本ISSR鉴别技术1)

张含国 张磊

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

朱航勇

(七台河市园林管理局)

徐悦丽姚宇

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学))

落叶松(Larix)是一些生长快、木材用途广、经济价值高的树种。长白落叶松(Larix Olgensis)、兴安落叶松(L.gmelini)和日本落叶松(L.Kaempferi)分别具有不同的优良性状:兴安和长白落叶松具有良好的耐寒性，日本落叶松生长迅速且不易感染早期落叶病，其杂交种多数具有双亲的优良性状。但不同的组合杂种优势存在较大差异，遗传增益差别很大［1－2］，所以对杂种落叶松类别的鉴定十分必要。虽然从形态标记［3］、细胞学标记［4］和生化标记［5］等方面有关于落叶松种间的鉴别，但因局限性所致影响了其使用。由于从分子水平对家系间鉴别的研究很少，因而，对于主要靠有性繁殖的树种来说，优良家系(杂种)的鉴别必不可少。自1994年加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等［6］发展了ISSR标记以来，因其在分析和应用上比RFLP、AFLP和SSR更加简便、快捷，而且又能比RAPD揭示出更多的多态性，现已在各种植物及林木的遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究方面得到了广泛应用，例如分析物种亲缘关系［7－8］、遗传作图［9］或者与其它分子标记相结合进行相关分析［10］等。本研究采用ISSR分子标记技术研究日本落叶松、兴安落叶松和长白落叶松及其子代的特异性，试图找出适合的引物，通过不同杂种扩增条带的差异，得到杂种和家系的鉴定方法，并根据遗传距离对杂种家系进行聚类分析，希望能够为不同杂种的准确鉴别提供新的途径和手段。

1 材料与方法

材料来源——试验材料来源于黑龙江省牡丹江市林口县青山林场的落叶松种子园子代测定林。材料包括生长性状优良的不同家系:兴安落叶松×日本落叶松5个，兴安落叶松×长白落叶松2个，日本落叶松×兴安落叶松8个，日本落叶松×长白落叶松5个，共计20个家系，单株241个。材料具体名称及数量见表1。采样时采取当年生嫩叶(松针)，置于冰上保存带回，之后在冰箱中－40℃保存，以备提取样本DNA。

植物基因组DNA提取——采用CTAB法提取植物总DNA，将用液氮研磨好的样品加入CTAB中，65℃水浴后使用氯仿异戊醇抽提，无水乙醇清洗沉淀，最后将沉淀溶于适量TE中［11］。

反应体系和程序——落叶松ISSR反应体系为:DNTP(2.5 mmol/L)1.4 μL，Buffer2 μL，Mg2+(2.5 mmol/L)0.4 μL，引物2 μL，Tag酶0.2 μL，DNA模板2 μL。去离子水12 μL，总体积共20 μL。扩增程序为:94℃预变性3 min，然后进行35次循环，包括94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，最后72℃总延伸7 min［12］。

扩增产物用含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳分离，最后在紫外灯下用GENE GENIUS摄像系统照相记录结果。

表1 家系名称及子代个数

数据分析——对所有引物扩增的电泳结果进行统计分析，根据ISSR扩增产物相同电泳迁移位置条带的有无，建立分子标记资料(多态性片段的数目、大小和信息量)的0、1数据。有带记为1，无带或模糊不清的条带记为0。用所有引物重复扩增1～2次，选择条带清晰稳定、重复性好的扩增产物统计相对分子量大小，记录结果。采用Popgen32软件进行数据处理，计算家系间的遗传距离，再以非加权两两对比法(Unweighted pair group methods of arithmetic(average)，UPGMA)［13］建立聚类图。

后期验证——在取材地点随机采集落叶松种及杂种的针叶，提取DNA，同时与实验室已有的样品一起用已筛选的引物进行扩增，然后记录电泳图片的数据，根据已有结果分析得出每个样品的种类，最后与实际结果比较。

2 结果与分析

2.1 ISSR分子标记的鉴别

在落叶松种间及无性系间能够用特异扩增条带进行鉴别的基础上［11］，进一步进行杂种子代与亲本、不同杂种组合间、双亲之一相同家系、正反交家系的鉴别。

引物编号及序列具体见表2。

表2 引物编号及碱基序列

2.1.1 不同杂种组合间鉴定

日本落叶松、兴安落叶松和长白落叶松为父本和母本相互杂交，得到4种不同的杂种落叶松，分别为日×兴、日×长、兴×日、兴×长。利用筛选好的ISSR引物对这4种不同的杂种落叶松进行扩增，对扩增结果分析发现:日×兴和兴×日的杂种落叶松很难区分，而日×长和兴×长杂交的子代可以通过扩增条带的特异性与其他杂种落叶松区别。

利用49个ISSR引物对不同杂种进行扩增，分析比较电泳图片后发现:16号ISSR引物可以鉴定兴安落叶松×长白落叶松。兴×长的子代在16号引物扩增的条件下，在相对分子质量1 500 bp处扩增出特异谱带，其它日×兴、日×长和兴×日的子代在这一位置均没有出现谱带(图1)。

1 ～7.日本落叶松×兴安落叶松;8～12.日本落叶松×长白落叶松;13～18.兴安落叶松×日本落叶松;19～24.兴安落叶松×长白落叶松;M.DL 2000 Marker。

19 号ISSR引物可以鉴定日本落叶松×长白落叶松。日×兴、兴×日和兴×长的子代在相对分子质量900 bp处均有扩增条带出现，而日×长白落叶松杂交的子代在19号引物的扩增下，在相同标准片断处没有任何扩增谱带(图2)。

图1 16号引物对不同杂交组合的扩增结果

1 ～7.日本落叶松×兴安落叶松;8～12.日本落叶松×长白落叶松;13～18.兴安落叶松×日本落叶松;19～23.兴安落叶松×长白落叶松;M.DL 2000 Marker。

2.1.2 双亲之一相同、家系不同的鉴定

试验材料中有涉及双亲之一相同的不同家系。以日5为父本、母本不同的家系2个，以日3为母本、父本不同的家系3个。

日5为父本、母本分别为兴6和兴12的2个不同家系，在38号ISSR引物的扩增下共出现6条扩增谱带。其中，在标准片段700 bp处，2个家系的子代扩增条带出现的几率有所不同。兴6×日5的子代(图3)出现扩增谱带的几率是88.89%，兴12×日5的子代(图4)在此处扩增出谱带的几率为10%。

图2 19号引物对不同杂交组合的扩增结果

图3 38号引物对兴6、日5及其杂交子代的扩增结果

图4 38号引物对兴12、日5及其杂交子代的扩增结果

结果表明，在已知父本为日5、而母本不确定时，用38号引物对子代样品进行扩增，根据700 bp扩增谱带的有无可判断家系的母本是哪个个体，如出现扩增谱带，则样品的母本为兴6的可能性大于其母本为兴12的可能性，其母本为兴6的可能性为89.89%，其母本为兴12的可能性为10.11%。如没有扩增谱带出现，则情况相反，其母本为兴6的可能性为10.99%，其母本为兴12的可能性为89.01%。

同样，在引物ISSR36的扩增下，以日3为母本，父本分别为兴2、兴8和兴9的3个不同家系的子代扩增出相对分子质量700 bp片段的几率有所不同。具体统计结果如表3所示。

表3 日3为母本，父本不同的家系利用ISSR36扩增的检测结果

2.1.3 正反交家系的鉴定

试验材料中有由父母双亲正反交所产生的不同家系，在对这些家系的电泳图片比较分析时发现，在不同ISSR引物的扩增下，有2对正反交组合可以进行区分。其中所涉及的4个家系每个家系各包括10个子代。

在用36号ISSR引物对由日5和兴12正反交所产生的不同的家系进行扩增时发现，子代在400 bp处出现扩增片段，而父本和母本均没有，其中兴12×日5的子代出现此片段的特异率达到了100%，而日5×兴12的子代出现此片段的特异率也达到90%(图5、图6)。并且，在相对分子质量700 bp处，兴12×日5的子代在相同位置只有20%扩增出颜色非常浅的条带，可以忽略不计(图5)，而日5×兴12的子代有80%扩增出条带(图6)。这可以说明，当已知样品为日5和兴12杂交所得，但不确定父母本时，用36号引物对其进行扩增时，可以在700 bp处扩增出条带的一定为日5×兴12的子代;反之，如在此位置没有扩增条带出现时，则样品为兴12×日5的可能性为71.42%。

图5 36号引物对兴12、日5及其杂交子代的扩增结果

图6 36号引物对日5、兴12及其杂交子代的扩增结果

在用32号ISSR引物对由日5和兴6正反交所产生的不同的家系进行扩增时发现，日5×兴6的子代在相对分子质量350 bp处有扩增条带出现，比率达到90%(图7)，而兴6×日5的子代在此位置除1个子代外，其余均没有扩增条带出现(图8)。结果表明:当用32号引物对已知为日5和兴12杂交所得的子代进行扩增，但不确定父母双亲时，如果有350 bp扩增条带出现，则样品是日5×兴6的可能性远远大于是兴6×日5的子代，且其母本为日5的可能性为81.82%。

图7 32号引物对日5、兴6及其杂交子代的扩增结果

图8 32号引物对兴6、日5及其杂交子代的扩增结果

2.2 遗传距离分析与杂种鉴别

以子代个体数相同的20个家系的遗传距离进行计算，其遗传距离的变幅及平均值分别为0.0161～0.4989和0.2642(表4、表5)。遗传距离最小的是日5×长77－1和日5×长77－3家系，遗传距离最大的是日3×兴9和兴9×日76－2家系。

表4 遗传距离分析中家系代号

利用软件绘制遗传关系聚类图。从家系间的遗传关系聚类图(图9)可以看出，在0.4的遗传距离上，可以将20个家系分为4类，分别是4种不同的杂交组合，即:日本落叶松×兴安落叶松、日本落叶松×长白落叶松、兴安落叶松×长白落叶松和兴安落叶松×日本落叶松。遗传距离的分类说明，不同落叶松杂种是可以进行区分的，与分子标记得到的结果基本吻合。

图9 家系间遗传关系聚类图

表5 20个家系的遗传一致度和遗传距离

3 讨论

目前，利用分子标记的方法对落叶松进行鉴定主要采取RAPD等方法，其中大多为种间的鉴定。主要研究有:管玉霞利用落叶松的部分叶绿体基因、线粒体基因和核糖体ITS序列，获得了rbcL基因上的一个SNP标记，并结合线粒体特异片断f－13、B－11可以对西部、美洲、日本和兴安、长白落叶松做出准确快速的鉴别［14］;曲丽娜等［15］用RAPD和ISSR分子标记对兴安落叶松、长白落叶松及日本落叶松进行了不同物种间的鉴定。对于其它针叶树种，虽然有人对无性系和杂交种进行过鉴别，但所用引物数量和所分析的无性系数量都较少［16］。张磊等［11］对长白落叶松、兴安落叶松和日本落叶松的种间、无性系进行了有效鉴别。而对于主要靠杂交育种及种子园等有性繁殖的落叶松来说，优良家系及杂种的鉴别十分重要。本研究的试验材料是从针叶中提取DNA，方法简单、容易操作，且适用于落叶松杂种的早期选择。在试验过程中，对记录数据结果的引物重复试验了12次，结果稳定可靠，并在试验后期对材料随机编号，然后用特异性引物对其进行扩增，得到的结果与实际结果相符合。

本研究找到的合适的引物能够对落叶松家系进行鉴别，可以为落叶松杂种优势早期预测、杂种优势机理研究提供技术支持。所有家系在0.4的遗传距离上可以分成4种杂交组合，说明不同杂交组合的落叶松可以通过遗传距离来进行区分。本研究表明，分子标记的结果可以真实、稳定地反映出家系间由于遗传关系造成的差别。

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