牛分枝杆菌三重PCR检测方法的建立

钱爱东，王 建，王春芳

(吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118)

牛结核病(Bovine tuberculosis)主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患传染病[1]。目前，牛结核病的防治主要采用牛结核菌素试验(PPD)进行变态反应检疫，对检出的阳性牛进行隔离或捕杀。然而，当感染副结核分枝杆菌等环境中的分枝杆菌时容易出现假阳性反应，并且不能辨别患病牛和BCG免疫牛[2-3]。应用该防治措施不能有效地控制牛结核病，反而使该病近年来呈上升趋势[4]。

研究证实，在M.bovisrecA基因中存在内蛋白插入位点。在recA-a位点存在一个1320 bp的内蛋白编码基因，该内蛋白只存在于M.bovis和结核分枝杆菌中，在其他分枝杆菌中均不存在，应用该内蛋白诊断结核病不受其他分枝杆菌的干扰[5-8]。IS6110是结核分枝杆菌复合体(MTBC)中共有的插入序列，其大小为1361 bp，为功能性转座子[9]。IS1081在MTBC中有6个拷贝[10]。因此，本研究以M.bovis recA、IS6110和IS1081为对象建立三重PCR反应，为研究新型诊断方法奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株M.bovisValleeⅢ株购自中国兽药监察所；人结核临床分离株为长春市结核病医院惠赠；副结核分枝杆菌、草分枝杆菌、猪大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、牛葡萄球菌和猪链球菌均为本实验室保存。

1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶、核酸分子量标准DL2000和dNTPs均购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。

1.3 染色体DNA的提取 将M.bovisValleeⅢ接种于改良的罗氏培养基中培养。7周后按文献[11]方法提取染色体DNA。

1.4 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的recA(BX248343)、IS6110(X57835)和 IS1081(X61270)基因序列，设计3对扩增引物，序列为：recA-P1(1965-1982)：5'-CGGATCACGGAATAGCGG-3'；recAP2(1117-1134)： 5'-GATGGCAGGGATGGTTGG-3'；IS6110-P1(3126-3143)：5'-TACGGTGCCCGCAAAGT G-3'； IS6110-P2(3633-3652)： 5'-TTGATCGTCTCGG CTAGTGC-3'； IS1081-P1(1268-1287)： 5'-ATCGGGT ACTCGACGCTCTG-3'；IS1081-P2(1597-1615)： 5'-G GGTGTTGGTGGTTTGCTG-3'；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。……