度洛西汀对大鼠胸主动脉环舒张功能的影响

郭芬芬，任俊杰，王 君，武冬梅，梁月琴，吕志杰

(山西医科大学1.药理学教研室，2.第一医院，山西太原 030000)

度洛西汀(duloxetine，DLX)化学名称为:(+)-(S)-氮-甲基-γ-(1-萘氧基)-2-噻吩丙胺盐酸盐，是5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)再摄取的双重抑制剂，通过抑制5-HT和NE再摄取发挥抗抑郁作用［1］。DLX抑制5-HT和NE的再摄取能力强，且作用均衡，2004年上市至今已成为全美乃至世界临床一线抗抑郁药，其市场占有率高［2］。由于对5-HT和NE再摄取的双重抑制作用，DLX对心血管系统的不良反应受到关注。国外报道，与安慰剂相比，DLX能明显增加心率和收缩压，Thase等［3］建议服用DLX治疗抑郁症时应该在用药前和用药的整个过程中密切测量血压。目前，对于DLX引起这些心血管不良反应的机制未见报道。本实验利用血管张力记录系统，观察DLX对大鼠胸主动脉舒张功能的影响并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康♂SD大鼠43只，体质量(250～300)g，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.1.2药品与试剂度洛西汀(duloxetine)，上海中西医制药有限公司生产，批号100701，规格20 mg/片。赛庚啶(cyproheptadine)，上海复旦复华药业有限公司，批号100503，规格2 mg/片。哌唑嗪(prazosin)，上海信谊药厂有限公司，批号110101 R，规格 1 mg/片。去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)，上海禾丰制药有限公司，批号090202，规格2 mg/1 ml。以上药品临用前均用生理盐水配制至所需浓度。乙酰胆碱 (acetylcholine，ACh)、Gli、TEA、BaCl2和4-AP均购自 Sigma公司。NaCl、KCl等化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3仪器BL-420F生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司;HSS-1B数字式超级恒温浴锅购自成都仪器厂;张力换能器(JH-2)购自高碑店市新航机电设备有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主动脉血管环的制备用钝器击昏大鼠，颈椎脱臼处死后，打开胸腔，分离胸主动脉，将取下的胸主动脉放入4℃的生理盐溶液(PSS)(mmol·L-1:NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，CaCl22.5，葡萄糖11.1，HEPES 5，pH 7.38)中。去除血管周围的脂肪及结缔组织，将动脉剪成3～4 mm的小段。血管环用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管管腔，横向悬挂在10 ml浴管内，下方固定，上方以一细钢丝连于张力换能器，其静息张力调节为2 g，使用BL-420F生物机能实验系统记录血管环张力变化。浴液为PSS液，浴槽中通以95%O2和5%CO2混合气，37℃平衡1 h，每15 min换液1次。以KCl 60 mmol·L-1收缩动脉环3次，如果前后两次最大收缩幅度差小于5%者，认为反应性可重复，方可用于正式实验。

1.2.2去内皮血管环的制备将修剪干净的胸主动脉环两端固定，用与血管内径相适的棉棒从管腔擦过，连续两次。血管环悬挂稳定1 h后，用KCl 60 mmol·L-1刺激，达到坪值后，加入 ACh(10 μmol·L-1)。舒张幅度不超过收缩幅度5%时，认为内皮去除完全，可以开始实验。

1.2.3DLX对KCl或NE预收缩内皮完整和去内皮大鼠主动脉环的影响内皮完整和去内皮的胸主动脉环，同时一次性加入KCl(30 mmol·L-1)或NE(1 μmol·L-1)，待血管环收缩达到稳定后，实验组累积加入DLX使浴管中的终浓度依次递增为(3、10、30 和 100 μmol·L-1)，对照组加入溶剂，观察血管反应。各组以加入1 μmol·L-1NE或30 mmol·L-1KCl诱发的血管环的最大收缩幅度为100%，计算加入不同浓度DLX后最大舒张百分比变化，建立浓度-效应曲线，并与溶剂对照组比较。

1.2.4钾离子通道阻断剂对DLX舒张作用的影响观察钾离子通道阻断剂对DLX舒张血管作用的影响时，主动脉环用KCl(30 mmol·L-1)预收缩，当血管收缩达到坪值后，实验组分别加入 Gli(10 μmol·L-1)、TEA(10 mmol·L-1)、BaCl2(1 mmol·L-1)、4-AP(1 mmol·L-1)，对照组加入溶剂，待各组再次反应达到坪值后，实验组和对照组分别累积加入 DLX(3 ～100 μmol·L-1)。

1.2.55-HT2受体阻断剂赛庚啶和α1受体阻断剂哌唑嗪对DLX舒张作用的影响观察5-HT2受体阻断剂赛庚啶和α1受体阻断剂哌唑嗪对DLX舒张血管作用的影响时，主动脉环用 KCl(30 mmol·L-1)预收缩，当血管收缩达到坪值后，实验组分别加入赛庚啶(1 μmol·L-1)和哌唑嗪(1 μmol·L-1)，对照组加入溶剂，待各组再次反应达到坪值后，实验组分别累积加入 DLX(3 ～100 μmol·L-1)。

1.2.6DLX对血管平滑肌钙内流和钙释放的影响血管稳定后，加入 NE(1 μmol·L-1)，收缩达坪值后洗脱，平衡1 h，然后用无钙生理盐溶液 (含EGTA 0.5 mmol· L-1)冲洗3次，DLX组中加入DLX(100 μmol·L-1)预孵 20 min，然后加入 NE(1 μmol·L-1)，可见血管出现短暂的收缩，待其恢复平稳以后，加入CaCl2(2.5 mmol·L-1)，可见血管再次收缩。对照组中加入溶剂预孵。记录相应血管张力并计算变化值，以1 μmol·L-1NE诱发的最大收缩幅度为100%，比较两组中NE与CaCl2最大收缩百分比的变化值。

1.3结果表示及统计分析以加入1 μmol·L-1NE或30 mmol·L-1KCl诱发的血管环的最大收缩幅度为100%，计算加入不同浓度DLX后张力变化百分比。实验结果均以±s表示。应用SPSS 16.0作统计分析，两样本t检验进行差异显著性检验。

2 结果

2.1DLX对内皮完整和去内皮主动脉环预收缩的影响DLX在(3～100 μmol·L-1)的浓度范围内对内皮完整和去内皮的大鼠离体胸主动脉环均具有浓度依赖性舒张作用(P＜0.01)。DLX对内皮完整组与去内皮组血管之间的舒张差异无显著性，KCl和NE预刺激内皮完整组和去内皮组最大舒张Emax分别为(-79.85±2.45)%、(-82.13±8.55)% 和(-85.71±2.92)%、(-80.53±9.04)%，说明DLX的血管舒张作用无内皮依赖性。见Fig 1。

Fig 1 Effect of duloxetine on the contraction induced by KCl(30 mmol·L －1，A)and NE(1 μmol· L －1，B)in isolated thoracic aortic rings with intact endothelium or without endothelium in rats(±s，n=6).＊＊P＜0.01 indicates significant differences of arterial rings intact endothelium or without endothelium from control.

2.2钾离子通道阻断剂对DLX舒张作用的影响在KCl(30 mmol·L-1)预收缩的血管环上，加入K+通道阻断剂Gli、TEA、BaCl2和4-AP，对DLX舒血管作用无影响，Gli阻断组 Emax=(-82.01±5.84)%、TEA阻断组Emax=(-81.35±1.12)%、BaCl2阻断组Emax=(-77.80±1.57)%、4-AP阻断组Emax=(-81.48±2.94)%。钾离子通道阻断剂不能抑制其血管舒张作用，DLX舒张血管可能与钾离子通道激活无关。见Fig 2。

Fig 2 Effects of Gli(10 μmol·L －1)，TEA(10 mmol· L －1)，BaCl2(1 mmol·L －1)，4-AP(1 mmol·L －1)on the relaxation induced by duloxetine in isolated thoracic aortic rings pre-contracted with KCl(30 mmol·L －1)(¯x ± s，n=6)

2.35-HT2受体阻断剂赛庚啶和α1受体阻断剂哌唑嗪对盐酸度洛西汀舒张作用的影响在KCl(30 mmol·L-1)预收缩血管环上，5-HT2受体阻断剂赛庚啶组对DLX舒血管作用无影响，其Emax=(-75.05±2.90)%。α1受体阻断剂哌唑嗪组对DLX舒血管作用有抑制作用，其 Emax=(-55.98±3.10)%(P＜0.01)。见Fig 3。

2.4DLX对血管平滑肌外钙内流和内钙释放的影响在无钙的生理盐溶液中，分别加入DLX(100 μmol· L-1)及溶液预孵20 min，加入 NE(1 μmol·L-1)，血管发生短暂的收缩，DLX组和溶剂对照组NE的收缩百分比分别为(6.88±1.26)、(24.09±4.17)，两者比较有统计学意义(P＜0.01)，见Fig 4。血管恢复平稳以后，加入 CaCl2(2.5 mmol·L-1)，DLX组和溶剂对照组CaCl2的收缩百分比分别为(15.29±2.22)、(89.00±2.34)，两者比较有统计学意义(P＜0.01)，见Fig 5。

3 讨论

NE作用于血管平滑肌上的α1肾上腺素受体，受体操纵性钙通道(receptor operated calcium channel，ROC)［4］开放，细胞外 Ca2+内流，同时激活磷脂酶C，引起膜磷脂酰肌醇水解，产生三磷酸肌醇，作用于肌浆网的三磷酸肌醇受体，促使肌浆网内Ca2+释放［5］;高钾引起血管平滑肌细胞膜去极化而刺激电压依赖性钙通道(voltage dependent calcium channel，VDC)开放，从而促使细胞外液中或与细胞膜疏松结合的Ca2+内流［6］。二者均通过细胞内游离钙浓度的增加而产生血管收缩。本实验观察到，DLX对NE或KCl预收缩的血管环具有直接舒张作用，表明DLX舒张血管可能与细胞膜上VDC和ROC通道有关。内皮完整与去内皮血管相比，其舒张作用没有差异，表明DLX所致的血管舒张与内皮无关。

Fig 3 Effects of cyproheptadine(1 μmol·L －1，A)and prazosin(1 μmol·L －1，B)on the relaxation induced by duloxetine in isolated thoracic aortic rings pre-contracted with KCl(30 mmol·L －1)(±s，n=6).*P＜0.05，＊＊P＜0.01

Fig 4 Effect of duloxetine on the NE-induced(1 μmol·L －1)contraction of rat thoracic aortic rings in free-Ca2+PSS(±s，n=6).

Fig 5 Effect of duloxetine on the NE-induced(1 μmol·L －1)contraction of rat thoracic aortic rings with CaCl22.5 mmol·L－1(±s，n=6).＊＊P ＜ 0.01 indicates significant differences of arterial rings pretreated with duloxetine from control

本实验观察到 KATP阻断剂 Gli、BKCa阻断剂TEA、Kir阻断剂 BaCl2和Kv阻断剂4-AP均不能抑制DLX的舒张血管作用，推测DLX舒张血管作用与钾通道无关。

其次观察到5-HT2受体阻断剂赛庚啶不能抑制DLX的舒张血管作用，推测DLX舒张血管作用与拮抗5-HT2受体无关。血管平滑肌上的α1肾上腺素受体被激活时，通过触发细胞内储存的Ca2+释放和细胞外Ca2+内流引起胞质游离Ca2+浓度升高［7］，从而引起平滑肌收缩。本实验观察到选择性的α1受体阻断剂哌唑嗪能部分抑制DLX的舒张血管作用，表明DLX舒张血管作用与拮抗α1受体有关。

在无钙的生理盐溶液中，加入NE可以引起血管短暂而快速的收缩，其收缩作用是内钙释放的结果［8］。随后在浴液中加入CaCl2后，血管再次收缩达峰值，其收缩作用是外钙内流的结果［9］。实验结果显示，提前用DLX预孵后，NE收缩血管的幅度明显降低，加入CaCl2后再次收缩达峰值的幅度也明显降低，进一步证明DLX是通过抑制外钙内流来舒张血管，同时也通过抑制内钙释放来舒张血管。

综上，DLX对KCl或NE预刺激的血管环的舒张作用可能是通过抑制经由血管平滑肌细胞膜VDC和ROC通道的钙离子内流，拮抗α1受体以及抑制胞质内钙离子释放而发挥作用的。DLX的这种对离体血管的直接舒张作用，是否与临床报道的DLX的心血管反应有关，其详细机制还有待进一步深入探讨。

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