改善氧化/抗氧化应激平衡及NET和5-HTT表达与瑞波西汀抗抑郁作用有关

李 娜，王 涵，文 威，周岐新

(重庆医科大学药理学教研室，重庆 400016)

抑郁症是一种以明显持久的情绪低落或心境改变为主要特征的精神障碍。具有高发病率、高自杀率和高疾病负担，已成为全球关注的疾病。然而，其确切发病机制至今未完全明了。近年来发现氧化应激和自由基增加在神经精神疾病发病过程中可能起着重要作用［1］。体内自由基诱导脂质过氧化反应生成丙二醛(melondialdehyde，MDA)，后者对机体组织细胞造成严重损伤。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)与过氧化氢酶(catalase，CAT)是脑内重要清除自由基的抗氧化酶类，能保护神经细胞免受自由基损伤。因此，机体氧化/抗氧化应激系统平衡可能涉及抑郁症发生、发展和缓解的过程。目前临床治疗抑郁症的药物主要包括5-HT再摄取抑制剂、去甲肾上腺素再摄取抑制剂和三环类抗抑郁药;它们的作用原理一般认为与抑制神经突触前膜5-HT转运体(5-HT transporter，5-HTT)和去甲肾上腺素转运体(norepinephrine transporter，NET)，使突触间隙内5-HT和NE水平升高有关。然而Jiang等［2］证明，5-HTT基因敲除小鼠显示抑郁行为，这似乎与上述药物抗抑郁原理相矛盾。为此，我们采用慢性轻度不可预见性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)建立大鼠抑郁模型，研究了选择性NE重摄取抑制剂瑞波西汀的给予对大鼠抑郁行为的影响及其与氧化/抗氧化应激平衡和脑桥NET和海马5-HTT表达关系。希望对抑郁症的发生机制和瑞波西汀的抗抑郁作用有新的认识和了解。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物清洁级♂Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，180～220 g，重庆医科大学动物实验中心提供，医学动物许可证号:SCXK(渝)2007-0001。

1.1.2主要试剂与仪器MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒、CAT测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，A003，A001，A007);甲磺酸瑞波西汀(重庆药友制药有限责任公司，原料药，纯度＞98%);PCR引物(上海鼎安生物技术有限公司);RNA store组织保存液、TRIzol总RNA提取试剂、TIANScript cDNA第一链合成试剂盒、2×Taq PCR MasterMix试剂盒 (TIANGEN 公 司，J8414，DP405，KR104，KT201);PCR仪(PTC200型，Bio-rad公司)。

1.1.3药物配制称取适量甲磺酸瑞波西汀，以5 g·L-1CMC-Na溶液配制成0.1 g·L-1混悬液，4℃保存。

1.2方法

1.2.1分组与给药♂ SD大鼠60只，自由摄食饮水，室温(20±3)℃，正常光照节律为 8:00～20:00，安静通风的实验环境适应3 d后，采用openfield法筛选大鼠，选取水平活动得分30～120之间的大鼠，随机分为4组，即正常对照组(NG)、模型组(MG)、瑞波西汀处理的模型组(RMG)和正常组(RNG)。每组15只，NG组和RNG组5只/笼，正常对照组大鼠自由摄食饮水，正常光照节律，MG组和RMG组采取孤养结合CUMS方式建模。每天上午刺激前1 h灌胃，瑞波西汀给予剂量为0.7 mg·kg-1·d-1，MG组和 NG组给予等体积5 g·L-1CMC-Na溶剂。

1.2.2孤养结合CUMS方式制备动物模型参照Willner等［3］方法并加以改进，建立实验性抑郁动物模型。刺激方式包括禁食24 h，禁水24 h，通宵照明，间歇照明(光/暗周期为2h/2h，时间20:00～8:00)，潮湿垫料18h，倾斜鼠笼45°24 h，4℃冰水游泳5 min，45℃热水浴5 min，夹尾1 min，水平震荡3 min，共10种刺激，每天随机安排给予1种刺激，每种出现2～3次，同种刺激不连续出现，实验周期为28 d。d 29，开场实验。d 30，糖水消耗实验。

1.2.3行为学检查

1.2.3.1开场实验(open-field)参照文献［4］，使用自制100 cm×100 cm×40 cm木箱，底部平均分为4×4个方格，木箱内全部漆成黑色。保持环境安静，将大鼠置于木箱中央，通过摄像系统和电脑视频系统连接，在计算机上观察大鼠5 min内的活动情况，记录大鼠的水平得分(四爪均进入方格的穿越格数)、垂直得分(后肢直立次数)和理毛次数。

1.2.3.2糖水消耗实验 参照文献［3］，于建模完成前训练大鼠试饮10 g·L-1蔗糖水24 h，随后饮纯水24 h，训练期间正常进食。训练结束开始实验:禁食禁水24 h后大鼠单笼放置，同时给予蔗糖水和纯水各1瓶。1 h后记录蔗糖水消耗量和纯水消耗量，并计算糖水偏好率(糖水消耗/总液体消耗×100%)。

1.2.4血清MDA含量和SOD、CAT活力测定建模完成后，每组取6只大鼠，断头取血，静置30 min后3 000 r·min-1离心10 min，分离血清-80℃保存。MDA含量和SOD及CAT活力测定按试剂盒说明书规范进行。

1.2.5海马病理形态学观察造模结束，每组取3只大鼠40 g·L-1水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉，仰卧固定，经左心室注入生理盐水100 ml，剪碎肝脏作为血液和灌注液出口，再注入40 g·L-1多聚甲醛磷酸盐缓冲液200 ml固定组织。取脑组织，剥离双侧海马，40 g·L-1多聚甲醛浸泡过夜，脑组织冠状切片，切片厚约4 μm，常规HE染色观察海马病理改变。

1.2.6脑桥NET和海马5-HTT mRNA表达测定

1.2.6.1取材 造模结束，每组取3只大鼠40 g·L-1水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉，断头取脑组织，分离脑桥和海马，置于装有RNA store组织保存液(每100 mg组织加入1 ml RNA store)的EP管，4℃过夜，移出液体，组织于-80℃保存。

1.2.6.2引物设计 由公司设计合成。引物序列及扩增片段大小见Tab 1。

Tab 1 Primer sequence and product size of NET and 5-HTT gene

1.2.6.3RT-PCR检测NET和5-HTT表达 以TRIzol法按试剂盒说明书提取脑桥和海马样本总RNA;取 1 μg总 RNA，用 TIANScript cDNA 第一链合成试剂盒逆转录合成 cDNA，反应条件:42℃30min→ 99℃ 5 min→ 4℃ 5 min→ 短时离心后-20℃保存。PCR扩增分别采用NET、5-HTT和βactin引物，扩增条件:94℃ 5 min解链→94℃ 30 s变性→60℃ 30 s退火→72℃延伸1 min(扩增循环NET 33次，5-HTT 31次，β-actin 28次)72℃充分 延伸5min。取15 μl RT-PCR产物，经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶数字扫描成像系统照相并测定条带积分吸光度，以待检基因条带与内参条带吸光度比值作为目的基因的相对表达量。

1.3统计学分析实验数据用±s表示，用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析，组间比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1瑞波西汀对CUMS致大鼠抑郁行为的影响

2.1.1开场实验(open-field)CUMS致大鼠(MG组)活动的水平得分、垂直得分和理毛次数都明显低于NG组，瑞波西汀预处理可逆转这种改变，瑞波西汀预处理对未接受CUMS刺激的正常大鼠活动无影响(Tab 2)。

Tab 2 Results of the rat behaviors observed in the open-field test(±s，n=9～15)

Tab 2 Results of the rat behaviors observed in the open-field test(±s，n=9～15)

＊＊P＜0.01，*P＜0.05 vs corresponding value of NG;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs corresponding value of MG.NG:normal group;MG:model group;RMG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated model group;RNG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated normal group.

Group Crossing Rearing Preening NG 68.5±23.3 20.1±10.4 5.3±2.8 MG 22.8±20.2＊＊ 6.9±5.9＊＊ 2.5±2.1*RMG 54.3±24.1## 15.2±7.2## 5.1±2.3#RNG 63.2±14.3 19.2±7.6 3.9±1.7

2.1.2糖水消耗实验与正常对照组［(81.2±16.1)%］相比，模型组［(35.8±33.6)%］大鼠糖水偏好率下降(P＜0.01);瑞波西汀预处理的模型组［(62.2±17.4)%］大鼠糖水偏好率较模型组升高(P＜0.01);瑞波西汀预处理的正常组［(76.0±9.6)%］大鼠糖水偏好率与正常对照组无差异。结合开场实验结果，说明瑞波西汀能明显改善CUMS诱导的大鼠抑郁行为。

2.2瑞波西汀对大鼠血清MDA水平和SOD及CAT活力影响与NG组比，MG组大鼠血清MDA水平明显升高(P＜0.01)，SOD、CAT活力下降(P＜0.01);瑞波西汀预处理能逆转这种变化;瑞波西汀预处理对正常大鼠血清MDA水平以及SOD、CAT活力均无影响(Tab 3)。

Tab 3 Concentration of MDA and the activities of SOD and CAT in serum of rats(x¯±s，n=6)

2.3瑞波西汀对海马病理形态学变化的影响NG组大鼠海马神经细胞呈圆形，结构清晰完整。与NG组相比，MG组海马齿状回、CA1、CA2和CA3区神经细胞均出现不同程度的核固缩和染色加深，细胞呈不规则多边形或梭形，细胞数目明显减少。瑞波西汀预处理明显减轻CUMS引起的海马神经细胞损伤，瑞波西汀预处理对正常大鼠海马神经细胞形态无影响(Fig 1)。

Fig 1 Hippocampal histopathology(HE，×100 and ×400)

2.4瑞波西汀对脑桥NET与海马5-HTT mRNA表达影响与NG组相比，MG组大鼠脑桥NET和海马5-HTT mRNA表达均明显降低(P＜0.01)。瑞波西汀预处理阻遏CUMS引起的大鼠NET与5-HTT mRNA表达(P＜0.01)降低，瑞波西汀预处理对正常大鼠NET与5-HTT mRNA表达无影响(Fig 2，Tab 4)。

Fig 2 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats

Tab 4 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats(±s，n=3)

Tab 4 Expressions of NET mRNA in pons cerebelli and 5-HTT mRNA in hippocampus of rats(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs corresponding value of NG;##P＜0.01 vs corresponding value of MG.NG:normal group;MG:model group;RMG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated model group;RNG:reboxetine(0.7 mg·kg-1·d-1)-treated normal group.

Group NET/β-actin 5-HTT/β-actin NG 1.37±0.09 0.44±0.01 MG 0.61±0.05＊＊ 0.26±0.01＊＊RMG 1.37±0.05## 0.52±0.05##RNG 1.34±0.08 0.48±0.04

3 讨论

CUMS模拟抑郁症的环境诱因，诱导实验动物形成的抑郁症核心症状能被经典的抗抑郁药物改善。因此该模型常用于抑郁症的病理生理机制和抗抑郁药物作用机制的研究［5］。本研究采用 CUMS建立大鼠抑郁模型，观察瑞波西汀干预对抑郁行为的影响与氧化/抗氧化应激平衡以及与特定情感活动密切相关脑区NET和5-HTT基因表达的关系。

本实验结果显示，CUMS致大鼠出现抑郁行为，同时显示血MDA水平升高和SOD及CAT活性降低，海马神经细胞出现明显病理形态学损伤，提示抑郁症大鼠体内出现氧化/抗氧化应激系统失衡，氧化应激的增强损伤了脆弱的海马神经细胞。相当于临床病人用量的瑞波西汀给予明显改善CUMS所致大鼠抑郁症状，阻遏MDA升高和SOD及CAT活性降低，减轻了海马神经细胞损伤。类似的氧化/抗氧化应激失衡可见于相关的临床抑郁症病例报道，但抗抑郁药治疗未观察到氧化/抗氧化应激平衡的改变［6-7］。这种动物模型与临床病人对抗抑郁药反应的差异提示临床抑郁症病因的复杂性。陈红霞等［8］也报道慢性应激可致海马CA1、CA3和齿状回神经元以及CA1区星形胶质细胞形状改变和数目减少。

众所周知，脑桥蓝斑核NE和海马5-HT神经元与情感障碍性疾病发病密切相关。因此，本课题研究了CUMS致抑郁大鼠脑桥NET和海马5-HTT基因表达变化及NET抑制剂瑞波西汀给予的影响。结果显示，CUMS诱导抑郁行为致大鼠脑桥NET和海马5-HTT mRNA表达均明显降低，瑞波西汀给予不仅逆转了NET mRNA表达降低，也逆转了海马5-HTT mRNA低表达。结果提示，抑郁症发生可能与NET和5-HTT基因呈低表达状态有关，而经典的抗抑郁药的治疗作用机制可能并非完全在于抑制NE和5-HTT转运体，而是提升其表达。本研究小组的另一实验也显示，5-HTT专一抑制剂帕罗西汀也对抑郁症大鼠的NET和5-HTT基因表达均有明显提升作用(未发表的资料)。上述研究结果增强了我们对经典抗抑郁药的作用可能与提升NET和5-HTT基因表达有关的信念。

本研究结果还揭示，未经受CUMS刺激大鼠接受治疗量(7 mg·kg-1·d-1)的瑞波西汀灌胃给予，其行为、体内氧化/抗氧化指标、NET和5-HTT基因表达均无明显影响。提示瑞波西汀抗抑郁作用有针对性。但 Zhao 等［9］报道，瑞波西汀(20 mg·kg-1·d-1)给予，连续40 d，使脑桥蓝斑核NET表达明显降低，缝际核5-HTT表达明显升高。此种差异可能与其实验的剂量过大和时间过长有关。

总之，本研究结果提示瑞波西汀的抗抑郁作用除与普遍认可的特异性NE重涉取抑制有关外，至少涉及改善机体氧化/抗氧化应激平衡和提升NET及5-HTT基因表达有关。

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