外源性多胺对老年大鼠抗衰老作用的实验研究

薛 过，王伟伟，赵雅君，张伟华，王丽娜，李红霞，张 力，徐长庆

(哈尔滨医科大学病理生理学教研室，黑龙江哈尔滨 150001)

衰老是一种自然现象，自由基学说和慢性炎性反应学说是目前解释衰老机制的两个重要学说，大量实验研究证明减少体内自由基产生、抑制炎症反应能防治衰老性疾病［1－2］。体内的天然物质多胺包括腐胺、精脒和精胺参与体内多种生理和病理过程，如稳定细胞膜、调节细胞内钙、促进细胞增殖、抗炎、抗氧化及抗凋亡等［3－5］。近年来关于多胺的研究取得了较多的进展，不仅以多胺代谢通路为靶点设计合成的抗肿瘤药物也为恶性肿瘤的靶向治疗提供良好的发展前景［6－8］，其在抗衰老方面作用的研究也有了新的发现［9］。本研究拟通过对自然衰老大鼠灌服多胺，观察外源性多胺对自然衰老大鼠心脏、肝脏氧化应激及炎症反应的影响，为多胺抗衰老作用机制的研究提供新的资料。

1 材料与方法

1材料

1.1主要试剂腐胺、精脒、精胺 (均购自Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号:970912，20041020)，大鼠 IL-1β、TNF-α 酶联免疫检测试剂盒购自中杉生物技术公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2主要仪器Beckman低温离心机;US-640型紫外分光光度计(美国，Beckman公司);BIO-RAD酶标仪(Model550美国，BioTek公司);恒温水浴锅(国产)。

2 方法

2.1动物给药及实验分组Wistar大鼠，清洁级，♂，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。动物饲养环境，室温20～22℃，光照充足，给予充足的标准饲料和饮用水。实验分3组，多胺给药组(polyamines):18月龄Wistar大鼠，体质量(500±50)g，多胺灌胃(精脒浓度0.01 mg·g－1，精胺浓度0.1 mg·g－1)，每天 1 次，灌胃容量 0.01 ml·g－1，连续给药6周，末次给药后禁食(不禁水)12 h取材。老年对照组(old):与给药组大鼠月龄相同、体重相当的老年大鼠，自由饮水、进食。青年对照组(young):体质量(280±20)g，自由饮水、进食的3月龄Wistar大鼠。

2.2大鼠心脏及肝脏组织SOD活力、MDA含量检测各组动物均给予体积分数为0.2的乌拉坦0.005 ml·g－1腹腔注射麻醉，迅速打开胸腔取出心脏、打开腹腔取出肝脏，在冷的生理盐水中漂洗、拭干。取心脏左心室及肝脏右侧叶，称重，加入10倍体积预冷的生理盐水，冰水浴中制成组织匀浆，4℃12 000×g离心10 min，上清贮存在－80℃直至分析使用。按照试剂盒说明书测定SOD活力、MDA含量。BCA法测蛋白含量。

2.3大鼠心脏及肝脏组织IL-1β和TNF-α含量测定取制备好的组织匀浆，应用酶联免疫吸附法按照试剂盒说明书测定 IL-1β和TNF-α含量。BCA法测蛋白含量。

2.4心肌组织超微结构观察实验结束后，取大鼠左心室心尖部约3.0×4.0×1.0(mm3)大小组织，置于戊二醛磷酸缓冲液中固定30 min，然后改刀切成体积约1～2(mm3)的小块，4℃继续固定24 h。常规脱水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射电镜下观察心肌组织超微结构。

2.5统计学处理所有数据用±s表示，各组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，应用SPSS16.0统计软件对数据进行处理。

3 结果

3.1多胺对衰老大鼠心脏组织中SOD活力、MDA含量的影响与青年对照组相比，老年对照组心肌组织SOD活力明显降低、MDA含量明显升高，差异均有显著性;与老年对照组相比，多胺给药组心肌组织SOD活力明显提高、MDA含量明显降低，差异均有显著性，见Tab 1。

Tab 1 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in cardiac tissue in aging rats(±s)

Tab 1 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in cardiac tissue in aging rats(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs young group;#P＜0.05 vs old group

Group n SOD/kU·g－1Pro MDA//μmol·g－1Pro Young 9 348.77 ±63.71 5.28 ±0.77 Old 9 225.57 ±56.55* 10.22 ±2.15＊＊Polyamines 7 346.08 ±18.23# 6.19 ±0.96#

3.2多胺对衰老大鼠肝脏组织中SOD活力、MDA含量的影响与青年对照组比较，老年对照组肝脏组织SOD活力明显降低、MDA含量明显升高，差异均有显著性;与老年对照组相比，多胺给药组肝脏组织SOD活力明显提高、MDA含量明显降低，差异均有显著性，见Tab 2。

Tab 2 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in liver tissue in aging rats(±s)

Tab 2 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in liver tissue in aging rats(±s)

＊＊P ＜0.01 vs young group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs old group

Group n SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Young 9 129.09 ±28.24 0.68 ±0.13 Old 9 101.36 ±14.81＊＊ 1.31 ±0.32＊＊Polyamines 7 129.60 ±34.13# 0.83 ±0.22##

3.3多胺对衰老大鼠心脏组织中TNF-α、IL-1β水平的影响与青年对照组相比，老年对照组心肌组织TNF-α与IL-1β含量均明显升高，差异均有显著性;与老年对照组相比，多胺给药组心肌组织TNF-α与IL-1β含量均明显降低，差异均有显著性，见Tab 3。

Tab 3 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in cardiac tissue in aging rats(±s)

Tab 3 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in cardiac tissue in aging rats(±s)

＊＊P＜0.01 vs young group;##P＜0.01 vs old group

Group n TNF-α/g·L－1 IL-1β/g·L －1 Young 9 16.14 ±4.17 45.37 ±3.98 Old 9 28.41 ±6.09＊＊ 64.76 ±7.25＊＊Polyamines 7 18.52 ±4.32## 47.19 ±5.64##

3.4多胺对衰老大鼠肝脏组织中TNF-α、IL-1β水平的影响多胺给药组与老年对照组相比，肝脏组织TNF-α、IL-1β含量均明显降低，差异有显著性。见Tab 4。

Fig 1 The morphology change in cardiac tissue of wistar rats under electron microscope

Tab 4 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in liver tissue in aging rats(±s)

Tab 4 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in liver tissue in aging rats(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs old group

Group n TNF-α/g·L－1 IL-1β/g·L －1 Young 9 69.55 ±7.63 75.91 ±4.73 Old 9 86.18 ±18.58 91.41 ±13.22 Polyamines 7 50.51 ±7.76＊＊ 70.73 ±16.66*

3.5多胺对衰老大鼠心肌组织超微结构改变的影响透射电镜下可见青年大鼠心肌肌丝排列整齐，线粒体密集、基质致密、线粒体嵴清晰，未见脂褐素颗粒;老年大鼠心肌超微结构可见线粒体数目减少、体积增大、基质疏松、线粒体嵴呈絮状变，并可见大量脂褐素颗粒沉积;多胺给药组与老年对照组比较，心肌超微结构的损伤变化明显减轻，可见心肌肌节结构清晰，线粒体基质较致密，线粒体嵴排列整齐，偶见脂褐素颗粒。见Fig 1。

4 讨论

大量实验证明，随增龄机体组织细胞氧自由基生成增加而清除能力降低，导致活性氧族(ROS)在体内或细胞内蓄积，ROS通过与细胞脂类、蛋白质及核酸等发生反应，产生脂质过氧化物，损伤细胞［1］。衰老机体的氧化应激可介导慢性炎症反应［2］。研究证实，与健康青年对照组比较，健康老龄组血清中 TNF-α，IL-1β，IL-6 的水平明显增加［10］。基于此，本研究观察了多胺(精脒、精胺)对老龄大鼠心脏、肝脏组织氧化应激水平及炎症介质生成的影响。结果显示，慢性给予老龄大鼠外源性多胺，能明显提高老年大鼠心脏、肝脏组织中SOD活力，降低MDA含量及TNF-α和IL-1β水平。说明多胺可通过提高组织细胞的抗氧化能力，抑制脂质过氧化物的生成，减轻炎症反应。线粒体是自由基产生的主要场所，老化使线粒体呼吸链电子传递功能下降，电子漏出增加，ROS生成增多，过量产生的ROS诱导线粒体衰老［11］。脂褐素是脂质过氧化反应过程中不同产物组分的堆积，是衰老的标志物［12］。本研究超微结构观察结果显示，外源性多胺能明显抑制衰老大鼠心肌组织中脂褐素的形成及心肌线粒体形态、结构的改变。因此，我们推测，多胺可能通过抗氧化、抗炎机制发挥抗衰老作用。

多胺具有广泛的生物学作用。我们前期的研究发现精胺可通过抗氧化、抗凋亡机制保护心肌缺血－再灌注损伤［13－15］。也有文献报道，多胺能抑制内毒素诱导的小鼠血清中炎症介质的释放［4］;多胺可通过清除羟自由基，维持谷胱苷肽和巯基的还原状态，抑制线粒体通透转运孔的开放等［3］。本研究我们证实外源性多胺可能通过抗氧化、抗炎机制延缓自然衰老大鼠的衰老进程，为抗衰老研究提供了新思路，但其具体在细胞及分子水平上的准确作用机制有待于进一步研究。

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