动物布氏菌病的诊断

毛开荣

（中国兽医药品监察所，北京海淀 100081）

布氏菌病（又称布鲁氏菌病，以下简称布病）是一种细菌性人畜共患传染病。世界大多数国家都有流行。由于带菌动物是其它动物和人类布病的主要传染源，因此，对动物的布病的诊断、防治就成为本病防治的关键。迄今，有多种技术成熟、可用国际标准来标定、比较的血清学方法可供诊断用。病原诊断也已经有成熟的分子生物学诊断技术。免疫学诊断方法方面的研究，主要集中在抗原筛选和新技术研究方面，包括脂多糖（LPS）、蛋白抗原的筛选研究，酶联免疫吸附试验（ELISA）诊断技术、荧光偏振试验（FPA）诊断技术、免疫层析法诊断技术、补体结合酶联免疫吸附试验（CF-ELISA）诊断技术、聚合酶链式反应（PCR）诊断技术等。此外。对诊断技术的评价研究也有大量报道。

一、诊断标准

诊断标准是得到官方认可的技术，具有法律效力。在布氏菌病的防控中，各国都有其诊断标准，国际组织也有其指定的或推荐的标准。各国的标准有的是相同的，有的不同，其差异主要在于技术研发的不同和根据国情对防控的需要不同。

中国有关动物布病的标准有3个。其中《动物布氏菌病诊断技术》（GBT 18646-2002）涉及的技术方法有：虎红平板凝集试验（RBT）、全乳环状试验(MRT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)。《奶牛布氏菌病PCR诊断技术》（NY/T 1467-2007）涉及的技术方法为PCR检测病原。《布氏菌病防治技术规范》（2007年7月17日农业部）则描述了流行特点、临床症状、病理变化、病原分离鉴定，并将GBT 18646-2002的 RBT、MRT、SAT和CFT列为标准内容，强调了病畜和疫情的综合判定方法，此外对疫情的报告处理，预防和控制进行了叙述，是比较全面的布氏菌病防控标准。中国有关人布病的标准是《布氏菌病诊断标准》WS268-2007，该标准规定诊断的依据是流行病学史、临床表现和实验室检查，实验室检查的方法包括用于初筛的平板凝集试验或RBT，血清学检查的SAT、CFT、抗人免疫球蛋白试验，以及分离细菌，规定了诊断原则，疑似、确诊、隐性感染诊断标准和鉴别诊断要点。《布氏菌病检测标准》GB 16885-1997是卫生系统起草和解释的国家标准，对监测点的选择、监测内容、监测方法作出了规定。

表1 欧盟成员国布病筛选和确诊试验

表2 某地区布氏菌检出年代分布情况

OIE作为世界贸易组织（WTO）指定负责制定动物卫生安全标准的唯一国际组织，其《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中关于牛布氏菌病和羊布氏菌病诊断技术也得到各国的重视。手册中有关布病病原诊断的技术有：细菌染色与分离鉴定、PCR检测；血清学诊断的技术有：作为国际贸易规定试验的RBT、缓冲平板凝集试验、CFT、ELISA、荧光偏振试验(FPA)，以及不作为规定试验的皮肤变态反应、SAT、用半抗原和胞质蛋白进行的免疫扩散试验、MRT、r-干扰素试验。

在欧盟牛布病诊断中，多数国家用RBT作为筛选试验，以CFT作为确诊试验，有些国家用SAT和 ELISA作为筛选试验，以CFT作为确诊试验。对于牛奶样品，多数国家用MRT作为筛选试验，以ELISA作为确诊试验，但也有国家仅用ELISA。有些国家还用皮肤变态反应。

美国在其2003年公布的布病消灭计划中，布病实验室诊断要求是：用酸化缓冲平板凝集试验、快速自动试验、卡片试验作为筛选试验，以标准试管凝集试验和标准平板凝集试验测定抗体滴度，用利凡诺尔试验、CFT、FPA作为确诊试验。MRT、系列稀释RBT和牛奶ELISA作为牛奶样品的监测试验。

从以上所述的国际组织和各国布病诊断标准中可以看出，对于布病诊断都采用了筛选试验与确诊试验相结合的标准规定，并且都以缓冲类平板凝集试验（包括RBT）作为主要筛选试验方法，在确诊试验中都包括了CFT，说明这2种试验是获得普遍认可的布病诊断技术。而MRT则是普遍使用的牛奶样品检测方法。

二、诊断方法及其评价

（一）病原学诊断方法

1.细菌学方法。世界上已发现布氏菌有9个种，其中田鼠种布氏菌(B.microti) 2008年由德国和捷克科学家发现，在我国流行的布病病原菌主要是羊种菌，此外，还存在牛种、猪种、犬种等。

迄今，细菌学方法依然是病原诊断的主要方法。传统的样品涂片染色镜检、分离培养鉴定，虽然检出率很低，但却是诊断“金标准”。但由于细菌学检测难以获得带菌样品等原因，其检出率很低，并且存在生物安全风险，因此在生产实践中使用率很低。

2.分子生物学技术。20世纪90年代以来，分子生物学技术以其快速、准确、高效成为布氏菌检测研究较多的方法。Betsy J BricKer和Shirley M Halling在1994年针对牛、羊、绵羊、猪种布氏菌设计不同的引物，应用PCR技术扩增在不同种间存在重复差异的布氏菌保守重复基因单元IS711,对美国107株野外分离菌株进行检测，能够全部鉴定，并与传统方法检测结果符合率达100%。说明这一方法在布氏菌种的鉴定方面敏感、可信，对美国流行种可以全部检出。1999年Serpe L等报道了用PCR一步法快速检测软质干酪和牛乳中的布氏菌。2000年Sreevatsan S等报道用联合PCR对感染牛的乳汁、鼻分泌物检测布氏菌和结核菌。Cloeckaert A等报道位于IS711序列下游的26bp基因是海洋哺乳动物的特殊标记。用过氧化物酶标记或荧光标记的特异性免疫染色检验技术已有报道，PCR和DNA探针技术有望不久成为病原诊断的实用方法。有一种叫做野外脉冲凝胶电泳的技术用于布氏菌病原鉴定，这种技术可以鉴别布氏菌各个种。PCR是用于鉴定布氏菌种型已是非常重要的工具，只需少量样品即可在短时间内得到结果， 基因指纹分析有助于流行病学研究和防控。对于布氏菌鉴定，基于PCR对方法比常规方法越来越实用，并且还在不断发展成熟。然而，要想用于实验室常规布氏菌病检测，其敏感性、特异性、质量控制和质量保证还需用大量临床样品进行全面验证。

（二）血清学诊断方法

1.凝集类试验。传统方法的凝集试验（包括SAT、平板凝集试验）在发达国家已基本上停止使用，取代的方法是缓冲布氏菌抗原试验，包括卡片试验、RBPT、缓冲平板凝集试验。在国际贸易中，缓冲布氏菌抗原试验是牛、羊、猪种布氏菌病诊断的指定试验，作为筛选试验用。

2.补体结合类试验。CFT至今仍是布氏菌病的重要诊断方法，是牛、羊、绵羊副睾种布氏菌病诊断的国际贸易指定试验，作为确诊试验用。但是，CFT不适合作为猪的个体诊断，因为猪的补体干扰豚鼠补体而使得试验的敏感性降低。尽管如此，欧盟和其他一些国家还是强调，猪的补体结合试验价低于20个国际单位。

最近，一种新的补体结合类试验技术——补体结合酶联免疫吸附试验（CF- ELISA）技术得到研发，并且显示出CFT的高特异性和ELISA的高敏感性，有望成为较理想的布氏菌病诊断技术。

（三）ELISA技术 ELISA是一种高敏感性的试验，操作方便的诊断技术。不但可用于血清学诊断，还可用于乳汁等检查。既可以作为确定试验，又可以作为筛选试验。但只有用于牛种布氏菌病的ELISA是国际贸易指定试验。猪种布氏菌和绵羊副睾种布氏菌亦已有成熟的ELISA诊断技术。其它种布氏菌病上的应用还需进一步改进抗原和积累数据。

ELISA技术的特点是：（1）高敏感性，（2）用针对IgG类抗体的酶标二抗提高试验点特异性。但由于此技术产品的质量控制较复杂，并且只检测IgG类抗体，在临床使用中还存在相当大的不稳定性。

关于ELISA的研究报道相当多，表明这是一种大家认为比较有前途的诊断方法。ELISA的效果关键在于抗原的选用。在已经标准化了的牛布氏菌病ELISA诊断中，使用了S-LPS抗原，以其为基础建立的方法得到了普遍认可，也有用胞壁和胞质蛋白进行的ELISA，由于对这些蛋白在体液免疫反应中的情况了解不够，其临床价值还需大量的研究证实。

（四）其它血清学诊断技术 由于凝集试验不适合绵羊副睾种布氏菌病的诊断，一种琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验就成为绵羊副睾种布氏菌病的常用诊断方法。但未被采纳作国际贸易指定试验。

对猪种布氏菌病来说，没有一种传统的血清学诊断方法是适用的，主要的问题在于断奶后2～3个月龄的猪是最易感的，但他们对感染的凝集类抗体的应答很有限。再有，耶尔森氏菌O:9感染在猪非常普遍，而布氏菌传统试验所使用抗原的主要有效成分——LPS与耶尔森氏菌O:9的LPS难以区分。猪血清有时还有非特异抗体（主要是IgM），对凝集类试验，尤其是SAT影响较大。因此，对猪布氏菌病的诊断，流行病学显得尤为重要，贸易中应避免从疫区引进动物。变态反应试验对猪种布氏菌病诊断有着很高的特异性，亦不与耶尔森氏菌发生交叉反应，但敏感性与凝集试验一样比较差，不适合作为个体猪的诊断。

（五）乳环试验（MRT） 这个试验依然是奶牛布氏菌病监测的常用技术。对于混合牛奶，有用增加试验牛奶样品量来提高其敏感性的方法。也有用虎红平板凝集试验抗原稀释法检测牛奶中抗体滴度的方法。

三、疫苗免疫后布氏菌病的诊断

目前世界范围内广泛应用的布氏菌病疫苗有2种，S19和Rev.1活疫苗。中国使用的疫苗有S2、M5、S(A)19活疫苗。这些疫苗都是光滑型布氏菌制备的，免疫后都产生干扰诊断羊种、牛种、猪种布氏菌感染的抗体。

自20世纪50年代开始，研究者为彻底解决疫苗免疫干扰诊断的问题，开始研究粗糙型布氏菌疫苗。报道实验室试验有效的不少于30种，从早期Jones等研制的R6、R7灭活佐剂疫苗，到后来的45/20灭活佐剂疫苗。最后都应免疫效果差或不是完全的无凝集原性而停止使用。上世纪90年代，美国研制出了一种粗糙型牛种布氏菌活疫苗RB51，据报道有相当于S19疫苗的免疫效力，同时不干扰常规血清学诊断，在美国已获得政府批准正式使用。

另一类解决的方法是，通过控制免疫程序，降低和缩短疫苗免疫后的抗体反应程度。比较成功的程序有：（1）用S19疫苗免疫3～8月龄的犊牛，6个月后，其抗体水平已降低至诊断阳性标准以下，还可以用竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）进一步降低免疫抗体阳性反应的可能性。（2）用S2疫苗口服免疫，适用于牛、羊、猪，并且可保证畜群的高免疫密度。其免疫抗体的反应程度比S19免疫3～8月龄的犊牛还低，6个月后，其抗体水平已全部降低至诊断阳性标准以下。

综上所述，在布氏菌病的诊断实践中，科学准确地判定病畜和疫情，需要以标准方法为准绳，同时结合适用的新技术，可参考的技术，才能获得理想的效果。

（略）