大劣按蚊感染约氏疟原虫defensins基因的克隆及生物信息学分析

张锡林,王英,陈继德,宋蓓

(第三军医大学基础部病原生物学教研室 重庆,400038)

蚊虫是人类感染疾病的重要传播媒介,能传播疟疾、淋巴丝虫病和多种虫媒病毒病。昆虫对各种病原体的入侵也会产生防御性免疫反应,产生的抗菌肽已被分离、鉴定[1],防御素(defensin)为其中的一大类,是广泛存在于生物界具有广谱抗微生物活性的小分子多肽,它对G+细菌、分枝杆菌、真菌和某些有包膜的病毒均有杀灭作用,对除了大肠杆菌外的G-细菌几乎无活性[2]。Defensins最早是从兔的肺泡巨噬细胞中分离出来,而昆虫的defensins最早是从果蝇中发现的[3]。蚊的defensins基因首先从埃及伊蚊体内分离出来的,迄今为止已发现了40多种昆虫defensins[4]。

大劣按蚊是东南亚地区和我国海南地区疟疾的主要传播媒介。按蚊的防御反应可通过激活黑化包被反应,杀死病原体。NO和抗菌肽的产生等机制可抑制体内疟原虫的发育。目前发现的疟原虫诱导按蚊产生的抗菌肽主要是防御素(defensins)[5],因此研究按蚊defensins的结构与功能,将有助于提高虫媒病的防治水平。本文以大劣按蚊雌蚊为材料,分别以约氏疟原虫进行诱导,对其体内defensins进行克隆及序列生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疟原虫和按蚊 约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)BY265株为本实验室保存的虫株:每周用昆明株小鼠血传 1次,每5周蚊传1次。大劣按蚊(Anopheles dirus)海南株:由本实验室在(24±0.5)℃、相对湿度(70±5)%的养蚊室饲养,供实验使用。

1.1.2 菌株 大肠杆菌(Escherirchia coli DH 5α)由第三军医大学微生物教研室提供。

1.1.3 主要试剂 T ripure试剂购自罗氏公司;MMLV逆转录酶、DEPC为Promega公司产品;Oligo d(T)15 、TaqDNA 聚合酶 、dNTP、DNA Marker 和pMD18-T载体试剂盒购自Takara公司。……