箬叶多糖对体外培养的宫颈癌细胞的抑制作用

刘 超 靳 祎 王恩军 卢雪峥 李双成

1.河北省保定市第一中心医院眼一科，河北 保定 071000;2.河北大学基础医学院，河北 保定 071000;3.河北省保定市第一中心医院神经内科，河北 保定 071000;4.河北医科大学基础医学院，河北 石家庄 050017

箬叶是禾本科植物箬竹 (Indocalamus tesselatus)的叶。它味甘性寒，有清热止血、解毒消肿之效，可以治疗吐血、下血、小便不利、喉痺、痈肿等病症［1、2］。现代医学研究发现箬叶中含有多种维生素、氨基酸、茶多酚、矿物质、多糖、黄酮类物质和各种芳香成分［3］，其中箬叶及箬竹根所含的多糖，对体内实验动物肿瘤具有抑制作用［4－6］。本试验采用人宫颈癌Hela细胞作为试验模型，研究箬叶多糖对体外培养的宫颈癌细胞的抑制作用，为宫颈癌的临床治疗提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料 ①箬叶多糖:由河北农业大学生命科学院提供，采用苯酚－硫酸法测定多糖含量为49.08%。试验前制成500 mg/mL的溶液，过滤除菌4℃保存，原生药购自江西九江市;②人宫颈癌细胞株Hela:由河北农业大学生命科学院提供。

1.2 仪器和试剂 CO2培养箱:美国SHELDON公司;净化工作台:苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;酶标仪:郑州博塞生物工程公司;倒置显微镜:奥林巴斯CKX41;48孔及96孔培养板:美国Costar公司;胎牛血清:天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;DMEM培养液和胰蛋白酶:GIBCO公司;顺铂:齐鲁制药有限公司;四甲基偶氮唑盐 (MTT)、二甲基亚砜 (DMSO):美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 Hela细胞的体外培养 将Hela细胞贴壁生长于DMEM完全培养液体系 (含10% 胎牛血清，青霉素和链霉素各100 U/mL)，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中进行培养，待细胞长至对数生长期时用DMEM完全培养基将细胞浓度调整为2×105个/mL的细胞悬液待用。

1.3.2 MTT法检测箬叶多糖对Hela细胞增殖的抑制作用按2×105个/mL的细胞密度将Hela细胞接种到96孔培养板中，终体积为每孔200 μL。试验分三组，阴性对照组加入生理盐水，阳性对照组加入顺铂 (浓度为20 μg/mL)，实验组加入不同浓度的箬叶多糖，终浓度分别为25 mg/mL，50 mg/mL，100 mg/mL，200 mg/mL，并设 4个平行孔，分别培养24h、48h和72h后加入MTT液 (5 μg/μL)20 μL，继续培养4h，弃上清液，加入DMSO每孔150 μL，震荡15 min，测定吸光度值 (A值)，测定波长λ=570 nm，参考波长 λ=630 nm，计算抑制率 (Grow inhibitory rate，GIR):

抑制率 (%)=(对照组A值－实验组A值)/对照组A值×100%，并计算箬叶多糖对Hela细胞半抑制率(IC50)。

1.3.3 形态学观察 取对数生长期的Hela细胞接种于48孔细胞培养板内，培养24 h，实验组加入100 mg/mL的箬叶多糖，对照组加入生理盐水，培养48 h后在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

1.3.4 统计学方法 应用The SAS system 6.12统计软件进行数据分析。所有数据用均数±标准差表示。两组间数据用t检验。

2 结果

2.1 箬叶多糖对体外培养的Hela细胞的抑制作用

2.1.1 箬叶多糖对Hela细胞抑制作用的量效关系 Hela细胞经不同浓度的箬叶多糖作用48 h后，细胞抑制作用明显，且随着药物浓度的升高，抑制率逐渐增强，剂量效应关系显著，与阴性对照组比较差异显著 (P﹤0.05)(表1)。

表1 不同浓度的箬叶多糖对Hela细胞的抑制作用n=4，

表1 不同浓度的箬叶多糖对Hela细胞的抑制作用n=4，

注:与对照组相比，#P﹤0.05，▲P﹤0.01

2.1.2 箬叶多糖对Hela细胞抑制作用的时效关系 4种不同浓度的箬叶多糖作用于Hela细胞24、48、72 h，Hela细胞的受抑制程度与时间有关，随着作用时间的延长，抑制作用明显增强，具有良好的时效关系 (表2)。

表2 箬叶多糖不同作用时间对Hela细胞的抑制率n=4，

表2 箬叶多糖不同作用时间对Hela细胞的抑制率n=4，

2.1.3 箬叶多糖对Hela细胞抑制作用的IC50

通过MTT法作出的Hela细胞生长曲线得出箬叶多糖抑制细胞生长50%时的浓度为157 mg/mL(48h)。

2.2 形态学观察 对照组宫颈癌Hela细胞呈扁平的不规则长梭形或多角形，核圆形，位于中央，排列无方向性，细胞边缘清楚，培养基内悬浮的细胞和碎片少;实验组箬叶多糖作用Hela细胞，胞膜起皱，数量减少，细胞呈圆形，与周围细胞脱离，培养基内悬浮的细胞和碎片多。

3 讨论

宫颈癌在女性恶性肿瘤中，发病率仅次于乳腺癌而位居第二。它占据了生殖器官癌症的一半以上，更是生育期和更年期这两个阶段发病率最高的疾病。临床上治疗宫颈癌主要采取手术、放化疗等综合治疗，但它们所带来的并发症也很多，而且化疗药物本身费用昂贵、久易耐药、毒性较大。而传统中医药积累了大量治疗妇科疾病的经验与验方，辨证论治对减少宫颈癌化疗和放疗的副作用均有较好的辅助作用，这对巩固和加强宫颈癌的治疗效果，延长患者生命和保证生存质量是具有积极意义的［7］。

箬叶，俗称竹箬、箬皮，即箬竹的叶子，别名辽叶、茶篰若叶，为禾本科植物箬竹的叶。箬竹是一种个子较矮的竹子，分布于东南亚一带，我国长江流域均有栽种，它叶片巨大，又有特殊芳香，用来裹粽最为适宜。箬叶除用于裹粽外，还有药用价值。上世纪80年代，德国和日本的医学家发现，中国包粽子的箬叶有抗癌作用。报告说，箬叶除一般营养成分外，还含有一种箬竹多糖，具有杀菌、防腐、抗癌的功用，日本已经用箬竹叶中提取的多糖来治疗喉、舌、胃、食管、鼻咽、腹腔等癌症，疗效显著。

本试验使用人宫颈癌Hela细胞作为代表细胞株，采用MTT法观察不同浓度的箬叶多糖对人宫颈癌细胞的作用。结果表明:不同浓度的箬叶多糖作用细胞后，对体外培养的Hela细胞有较强的抑制作用;且抑制程度与箬叶多糖的浓度和作用时间有关。浓度越高抑制作用越强，作用时间越长抑制效果越明显，显示典型的量效关系和时效关系，对Hela细胞的IC50为157 mg/mL。另外细胞毒性的形态学观察结果显示箬叶多糖作用于细胞后，可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化，说明箬叶多糖对体外培养的Hela细胞有明显的抑制作用，这为今后进一步研究箬叶的抗肿瘤作用机制提供了试验依据。

［1］艾文胜，汤腾方，杨建胜等.箬竹利用现状及叶用园营建技术［J］.林业科技开发，2006，20(1):69－71.

［2］季宇彬.中药多糖的化学与药理［M］.北京:人民卫生出版社，2005，226－230.

［3］李水芳，李姣娟.箬叶化学成分的比较研究［J］.食品研究与开发，2008，29(12):7－10.

［4］陈春英，丁玉强，E.A.ELMAHADI等.碱液提取箬叶多糖的纯化及其结构性质的研究［J］.生物化学与生物物理进展，1999，26(1):51－55.

［5］蒋岩，陈春英，裴丽健等.硫酸酯化箬叶多糖抗HIV－1机制的初步研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2000，14(1):56－59.

［6］张赛丹，方岩雄，陈敏敏等.几种传统中药中多糖的提取及抗肿瘤活性研究［J］.中药材，2007，30(2):179－182.

［7］关素洁.宫颈癌的发病机制及中医药治疗研究进展［J］.中医药导报，2007，13(2):95－97.