一株新城疫病毒的分离鉴定

文│邹立宏 [瑞普（保定）生物药业有限公司]

翟含流（河北省保定市北市区动物卫生监督）

新城疫（Newcastle disease， ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一种侵害禽类的急性、高度接触性传染病。2011年6月，某肉鸡养殖场爆发了疑似新城疫的病情，鸡群34日龄发病，表现为精神沉郁、食欲不振，采食量下降50%、并伴有严重的呼吸道症状，拉绿色粪便。发病率20%左右，死亡率14%左右。剖检发现气管环出血、肌胃底部、腺胃潮红，十二指肠、卵黄蒂附近有枣核状溃疡和出血，盲肠扁桃体出血，直肠条状出血，肾脏肿胀。为了对该病作出准确诊断并制定出有效的防控措施，采集病鸡气管、肾脏、脑等组织，进行病原的分离与鉴定。

一、材料与方法

1.材料。

（1）SPF鸡胚及SPF鸡。9～11日龄SPF鸡胚和SPF鸡均购自北京梅里亚-维通实验动物技术有限公司。

（2）标准阳性血清。ND标准阳性血清、禽流感（A1）H9、H5标准阳性血清，均购自中国农科院哈尔滨兽医研究所。

2.方法。

（1）病毒分离。无菌采集病死鸡气管、肾脏、脑，放入研钵中剪成小块，加入灭菌的PBS冲洗，洗去红细胞，反复2～3次。然后将病料加入研磨器中磨碎，加少量灭菌PBS液稀释，反复冻融3次后，5000转/分钟离心10分钟，取上清，用0.22微米的滤膜滤过除菌，将滤液接种10日龄SPF鸡胚，37℃培养，无菌收集尿囊液（弃去24小时死亡鸡胚），-20℃保存。

（2）血凝性检测。收获鸡胚尿囊液，进行血凝（HA）试验。

（3）血凝抑制试验。按常规将具有血凝性的病毒，分别与新城疫、禽流感（H9或H5）阳性血清进行交叉HI试验。

（4）病毒毒力的测定。按常规方法，分别测定鸡胚半数致死量（ELD50）、最小致死量致死鸡胚的平均时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内致病指数（ICPI）。

（5）动物回归试验。取10只35日龄的SPF鸡，将分离毒经滴鼻、点眼途径攻毒，每只鸡攻10-5ELD50/0.1毫升，观察鸡群变化。

二、结果

1.病毒分离鉴定。SPF鸡胚在接种分离病毒后48小时内死亡，死亡鸡胚全身严重出血、水肿，肝脏有坏死和出血点。鸡胚尿囊液的血凝价为28，和抗NDV标准阳性血清、抗AIV H9亚型与H5亚型标准阳性血清及阴性血清进行HI试验，结果见表1。

表1 SD1106株尿囊液和参考血清的HI试验结果

2.病毒毒力的测定。新城疫分离株的ELD50为10-7.74；MDT为51.7小时（强毒40～60小时）；ICPI为1.91（1.6～2.5），由此可见，该新城疫分离株为强毒。

3.动物回归试验。10只SPF鸡，在攻毒后48小时左右鸡只出现精神沉郁，表现为闭眼、嗜睡、不愿行动，采食下降，并出现严重的呼吸道症状， 144小时内全部死亡，剖检出现典型的新城疫症状：腺胃乳头点状出血、十二指肠出血、卵黄蒂、回肠处的淋巴滤泡出血、盲肠扁桃体出血、气管内有黏液、气管环出血。

三、讨论

本研究通过HA-HI试验和动物回归试验，证明分离到的毒株为新城疫病毒，通过毒力测定，MDT为51.7小时，ICPI为1.91。根据目前NDV毒力判定标准MDT40～60小时为强毒，ICPI1.6～2.5为强毒。分离到的毒株为新城疫强毒株。

新城疫的发生与流行与日常的饲养管理、疫苗的种类、免疫程序等有很大关系，同时，新城疫病毒发生部分抗原变异也可能是一个重要因素。曹殿军等对我国分离株进行了系统的分析，我国流行的NDV既有基因I、II、III、IV、V、VI，又有新的基因VII、VIII型的流行，而我国目前使用的疫苗大多属于基因I、II，与一些流行毒株基因型有较大不同，所以用常规疫苗进行鸡群的免疫不能获得有效的保护。