高效液相色谱-荧光法测定谷物类农产品中阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素的多残留量

周海明

(浙江省嘉兴市种植业技术推广总站，浙江 嘉兴 314411)

自1985年阿维菌素(abamectin，ABA)是阿维菌素投入农药市场后，通过对母体进行半合成化学结构改造，已开发了伊维菌素(ivermectin，IVM)、埃玛菌素(emamectin，EMA)、道拉菌素(dormectin)、埃珀利诺菌素(eprinomectin)和色拉菌素(selamectin)等系列衍生品种，形成一大类阿维菌素类农药［1－2］。该类农药具有杀虫谱广、杀虫活性高、易与多数农药混配使用等优点。阿维菌素类农药在我国农业生产已广泛地应用，是我国目前使用范围最广的杀虫剂之一［3］。自2008年我国农业部批准阿维菌素和埃玛菌素在水稻生产上使用，阿维菌素类农药已在水稻、小麦、玉米等大田作物上大量使用。2008年威远生化公司的阿维菌素产品-蓝锐在水稻上销量已突破亿元。

目前世界各国农产品中阿维菌素类农药的最高残留限量(MRL值)已有标准限定［4］。由于检测灵敏度高且不需要昂贵的仪器，液相色谱-荧光法(HPLC-FD)已成为目前最常用的阿维菌素类农药残留检测方法［5－7］。在文献报道中，已有很多关于畜产品［8］、蔬菜［9］、水［10］等样品中阿维菌素类农(兽)药残留分析的论文发表，但对于谷物类农产品中阿维菌素类农药残留分析的研究还比较少［11］，并且多是单残留分析。本文通过研究建立了同时检测谷物类农产品中阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素的多残留分析方法，为谷物类农产品中阿维菌素类农药残留分析提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters 2696 Alliance高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters 474扫描荧光检测器(美国Waters公司)，超纯水器(美国 Milli-Q公司)，Kultra turrax高速匀质机(德国 IKA公司)，NEVAPTM111氮吹仪(美国 Organomation Associates Inc公司)，KQ-500B型超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

阿维菌素、埃玛菌素、伊维菌素、三氟乙酸酐(TFAA)和N-甲基咪唑(NMIM)均为分析纯试剂(美国Sigma-Aldrich公司)，乙腈、甲醇、丙酮均为HPLC级产品(德国默克Merck公司)，氯化钠为国产分析纯产品。

1.3 标准溶液配制

储备液:称取阿维菌素、埃玛菌素、伊维菌素3种标样各10 mg，用过无水硫酸钠的乙腈溶解，分别配成质量浓度为100 mg·L－1标准溶液作为储备液。

标准工作系列:分别移取一定体积的阿维菌素、埃玛菌素、伊维菌素标准储备液，用无水乙腈分别配制成 10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L－1的混合标准溶液。

1.4 样品前处理

糙米、小麦和玉米样品先用粉碎机粉碎，再过100目(0.149 mm)筛，放在－20℃冰箱中保存备用。准确称取粉碎样品20 g放入250 mL平底玻璃瓶中，加入10 mL水和50 mL乙腈。在高速匀质器以14 000 r·min－1处理2 min后，提取样品在超波清洗机上超声辅助提取处理15 min，然后在10 000 r·min－1条件下离心5 min，上清液装入预装5～7 g氯化钠的100 mL具塞量筒中。具塞量筒剧烈震荡5 min后静置30 min，使乙腈相和水相分层。从乙腈相中吸取20 mL提取液转移至25 mL玻璃试管。提取液在氮吹仪上吹干后，试管中加入0.5 mL过无水硫酸钠的乙腈，在超声波清洗机上超声1 min，使农药残留完全溶于乙腈。

1.5 柱前衍生化

在避光条件下，分别把0.1 mL N-甲基咪唑和0.2 mL三氟乙酸酐按先后顺序加入装有0.5 mL待衍生化样品或标准溶液试管中，振荡摇匀后静置反应30 min。试管中再加入1.2 mL甲醇摇匀，避光反应1 h后，过0.45 μm有机滤膜进行 HPLC-FD测定。

1.6 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流动相:起始为水-乙腈-甲醇(体积比5∶10∶85)，5 min后为乙腈-甲醇(体积比20∶80)，流速为1.0 mL·min－1。检测波长:荧光激发波长365 nm，发射波长475 nm。柱温:40℃。进样量:20 μL。定量方法:外标法(峰面积)。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

阿维菌素类药物是弱极性化合物，在水中的溶解度低，易溶于乙腈、丙酮、甲醇、乙醇等极性有机溶剂。以糙米为代表样品，分别研究不同有机溶剂(丙酮、乙腈、甲醇和正己烷)对阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素的提取效率(表1)。结果发现，用乙腈提取的平均添加回收率最高，变异系数最小。丙酮提取液杂质多，易干扰目标物测定，变异系数较大，其原因可能是丙酮的极性比乙腈强，易把样品中淀粉、蛋白质、糖类化合物等极性杂质提取出来，同时由于丙酮在常温下挥发性非常强，影响提取液的体积计算，从而造成回收率变异系数大。正己烷的回收率最低，一方面是正己烷对阿维菌素类农药提取能力不够，另一方面可能因为正己烷是强非极性溶剂，它无法浸润进入样品，与样品接触不充分。在实验中发现利用氯化钠盐析作用很难使甲醇与水相完全分离，所以甲醇不适用作此方法。

考虑到糙米、小麦和玉米都是干燥样品，单独采用乙腈提取时，溶剂在样品上无法充分浸润展开，难以保证溶剂与样品的充分接触，所以采用乙腈与水混合作为提取溶剂，以促进提取溶剂与样品的相互接触。与此同时，采用超声辅助萃取方法加速样品中阿维菌素类农药溶于提取溶剂，提高提取效率。

表1 不同提取溶剂对3种阿维菌素类农药的回收率(n=3)

2.2 色谱条件优化

由于阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素是同类化合物，化学结构与性质都非常相近，因此它们在色谱分离上有一定难度，对色谱分离条件要求较高。为了使它们在色谱柱上有适当的保留时间和有效分离，选用了Kromasil C18column(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)、SB-C8column(150 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)、Inertsil ODS-3 column(150 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)等不同类型的反相色谱柱进行实验。实验结果表明，这3种阿维菌素类农药在C18色谱柱上峰形对称，重现性好，有合适的保留时间。

在优化流动相实验中发现，用乙腈或甲醇与水的固定比例作流动相难以有效分离这3种性质相近的农药，同时又要避开杂质峰干扰。因此，采用了乙腈-甲醇-水三元梯度洗脱程序对它们进行色谱分离。通过实验优化确定了最佳流动相为:起始为水-乙腈-甲醇(体积比 5∶10∶85)，5 min 后为乙腈-甲醇(体积比20∶80)，持续10 min后结束检测;流速一直保持在1.0 mL·min－1;柱温为40℃。由图1可见:阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素在小于12 min保留时间内都能出峰，获得了很好的分离效果。

图1 阿维菌素类农药的标样色谱

2.3 标准曲线

在上述色谱条件下，分别检测质量浓度为10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L－1阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素的混合标准溶液，以农药质量浓度与峰面积做线性回归得标准曲线方程和线性相关系数(表 2)。在 10 ～5 000 μg·L－1范围内农药的峰面积与其质量浓度呈良好的线性关系，它们的相关系数(R2)均大于0.999。以4倍信噪比(S/N=4)为计，可分别得出阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素的最低检测限分为 5，10，5 μg·L－1。由此可算出，谷物类农产品中阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素的最低检出质量浓度分别1，2，1 μg·L－1，低于其MRL值一个数量级以上。因此，该方法检测范围和灵敏度完全能满足残留分析要求。

2.4 添加回收实验

将阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素的混合标准液分别添加到糙米、小麦和玉米样品中，添加质量分数为0，10，100，1 000 mg·kg－14个组，批内有3个重复，共完成3次批间处理。为了保证添加质量浓度与样品混匀，添加农药后样品避光密封振荡过夜，采用上述检测方法进行检测实验。研究结果(图2－3)表明:经过前处理和柱前荧光衍生反应后，糙米、小麦和玉米样品的色谱图中杂质峰非常少，对这3种目标物检测结果不会产生影响。由表3－5可见:阿维菌素在糙米、小麦和玉米中的添加回收率为85.1%～109.3%，精密度为3.10%～12.44%，准确度为－14.9% ～9.3%;埃玛菌素的添加回收率为85.2% ～93.4%，精密度为2.04% ～9.03%，准确度为－14.8% ～－6.6%;伊维菌素的添加回收率为86.1%～97.3%，精密度为2.98% ～11.07%，准确度为 －13.3% ～－7.4%。由此可见，研究方法的回收率、精密度和准确性完全达到残留分析要求。

表2 农药的保留时间、标准曲线及线性相关系数

图2 空白对照糙米样品的色谱

图3 添加农药后糙米样品的色谱

表3 阿维菌素类农药在糙米样品中的添加回收率、精密度及准确度(n=3)

表4 阿维菌素类农药在小麦样品中的添加回收率、精密度及准确度(n=3)

表5 阿维菌素类农药在玉米样品中的添加回收率、精密度及准确度(n=3)

2.5 检测真实样品

采用本文方法对130个市场抽查的糙米样品进行检测。结果(图4)表明，有1个样品检出阿维菌素质量分数为8.4 μg·kg－1，检出率为0.8%，埃玛菌素和伊维菌素未检出。

3 小结

采用HPLC-FD检测糙米、小麦、玉米等谷物类农产品上阿维菌素、埃玛菌素和伊维菌素的多残留分析方法。以乙腈作为提取溶剂能充分提取阿维菌素类农药残留，同时减少杂质提取。流动相采用乙腈/甲醇/水三元梯度洗脱程序后，3种阿维菌素类农药在合适的保留时间内能获得有效分离，同时避开杂质干扰。采用高效的荧光衍生化后，该方法具有很高的灵敏度，最低检出浓度低于MRL值近一个数量级以上。添加回收实验表明本文方法的选择性高，准确性和精确性都能达到农药残留分析要求，在检测真实样品上得到很好的应用。

图4 抽检糙米样品的检测色谱

［1］Campbel lW C，FisherM H，StapleyE O，et．al．Ivermectin:a potent antiparasitic agent［J］．Science，1983，221:823-828.

［2］Yoshii K，Kaihara A，Tsumura Y，et al．Liquid chromatographic determination ofemamectin，milbemectin，ivermectin and abamectin in crops and confirmation by liquid chromatography-mass spectrometry［J］．Journal of Chromatography A，2000，896:75-85.

［3］谢显传，张少华，王冬生．柱前衍生高效液相色谱法测定果蔬产品阿维菌素及其有毒代谢物的残留量［J］．中国农业科学，2005，38(11):2254-2260.

［4］农业部农药检定所．农药合理使用准则实用手册［M］．北京，中国标准出版社，2002:1-2.

［5］谢显传，张少华，王冬生．阿维菌素荧光衍生反应影响因子的研究［J］．分析化学．2006，34(12):1745-1748.

［6］Roudaut B．Multiresidue method forthe determination of avermectin and moxidecticn residues in liver using HPLC with fluorescence detection［J］．Analyst，1998，123:2541-2544.

［7］Valenzuela A I，Popa D S，Redondo M J．Comparison of various liquid chromatographyic method for the analysis of avermectin residues in citrus fruits［J］．Journal of Chromatography A，2001，918:59-65.

［8］程传民，冯娅．高效液相色谱法测定动物源食品中阿维菌素类药物残留量［J］．饲料工业，2009，30(20):54-55.

［9］赵莉，谢显传，占绣萍．高效液相色谱-荧光法同时检测蔬菜中阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和伊维菌素的多残留量［J］．中国农业科学，2010，43(16):3467-3472.

［10］秦改晓，袁科平，艾晓辉．高效液相色谱法测定水产品中阿维菌素的残留量［J］．华中农业大学学报，2009，28(1):84-88.

［11］章虎，钱鸣蓉，董程，等．液相色谱法同时测定稻米中阿维菌素和甲维盐残留［J］．浙江农业科学．2010(6):1358-1361.