糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌组织中CNP和NPR-B蛋白含量变化

蔡英兰，朴丽花，张默函，姜京植，金 政

(延边大学基础医学院，吉林 延吉 133002)

糖尿病患者普遍存在胃肠功能紊乱，报道约75%的糖尿病患者有胃肠道症状，如腹胀、上腹不适、便秘等［1］，导致降糖药吸收迟滞，血糖控制不良，还可能引起低血糖等。但糖尿病致胃肠动力紊乱的机理仍不完全清楚。胃肠道中存在钠尿肽(NP)—钠尿肽受体(NPR)-B/pGC-cGMP和 NO-sGC-cGMP两种信号转导途径［2］，均参与胃肠动力调节。研究表明，胃肠道内 NP及NPR对豚鼠、大鼠和人胃平滑肌自发性运动均发挥抑制性调节作用［3，4］。本研究组前期研究证明，糖尿病胃动力障碍大鼠C型钠尿肽(CNP)抑制胃窦平滑肌收缩的作用明显增强［5］。我们于2009年12月～2010年5月进行本研究，拟继续探讨糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌对CNP敏感性增强的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雌雄不限，体质量220～250 g，由延边大学实验管理科动物实验中心提供。链脲佐菌素(STZ)(Sigma);CNP、NPR-B抗体(Santa Cruz);RM-6240多道生理信号记录系统(中国成都仪器厂);TD-2000型真彩病理细胞显微分析系统(北京天地百年科技有限责任公司)。

1.2 动物模型的制备 Wistar大鼠禁食12 h，自由饮水，腹腔注射STZ(65 mg/kg)制备糖尿病动物模型。正常对照组大鼠腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。造模成功后大鼠均单笼饲养4周，自由进食、饮水。将大鼠击头致昏，沿中线剖腹取全胃，放入4℃氧饱和的 Kerb’s液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.75 mmol/L、CaCl22.54 mmol/L、KH2PO41.19 mmol/L、MgSO41.19 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，充以95%O2和5%CO2的混合气体，pH 7.2～7.4)中，沿胃小弯侧剪开，漂洗出胃内容物。小心剪去黏膜层，在距幽门近口端5 mm处沿胃窦环行肌纤维走行方向剪取2 mm×12 mm的环行肌条。取下的肌条放置于Kerb’s液垂直灌流槽中，其一端固定在铂丝钩上，另一端与张力换能器相连，灌流槽内温度维持在37℃，并持续供给95%O2和5%CO2的混合气体。每次实验时均给予1 g前负荷，在氧饱和的Kerb’s液灌流槽中孵育40 min，待肌条自发性收缩稳定后，通过RM-6240多道生理信号记录系统同时记录正常对照组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌收缩活动、肌条收缩运动的振幅和频率。将收缩频率明显慢于正常的大鼠列入糖尿病胃动力障碍大鼠模型。

1.3 免疫组织化学方法 取胃窦部组织用4%甲醛缓冲液固定24 h。常规方法进行免疫组化实验。兔CNP抗体1∶600稀释，NPR-B抗体1∶600稀释。观察正常对照组及糖尿病组大鼠胃窦组织中CNP的分布。选取部分胃组织切片作为阴性对照(用PBS替代兔CNP抗体)，与其他切片在同一条件下进行染色。

1.4 实验结果判定 两组随机抽取3张切片，每张切片随机取3个视野，按胃窦平滑肌CNP及NPR-B显色程度分弱、中、强3种，分别计1、2、3分，用TD-2000医用真彩色图像分析软件计算相应范围，将显色程度和范围换算成显色指数。显色指数=显色程度×显色范围。

2 结果

2.1 胃窦平滑肌CNP分布 正常对照组及糖尿病组大鼠胃窦组织均有CNP蛋白阳性表达，即可见棕色颗粒，主要见于肌层。正常对照组CNP蛋白显色指数为(41.26±0.71)%，糖尿病组为(41.71±0.21)%，两者CNP蛋白显色指数比较无统计学差异(P ＞0.05)。

2.2 胃窦平滑肌NPR-B的分布 正常对照组胃窦平滑肌细胞NPR-B呈阳性，可观察到散在分布的棕色颗粒，NPR-B蛋白显色指数为(17.63±1.49)%;糖尿病组胃窦平滑肌细胞NPR-B也呈阳性，但与正常对照组相比呈阳性的棕色颗粒明显增多、染色明显加深，NPR-B蛋白显色指数为(30.67±1.59)%。两组NPR-B蛋白显色指数比较P＜0.01。

3 讨论

NP通过与细胞膜上的NPR结合而发挥生物学作用［6］。NPR 主要有 3种:NPR-A、NPR-B 和 NPRC，均属于膜受体。CNP主要与NPR-B结合［7］。NP抑制胃平滑肌的作用机制主要是通过NP-NPR-B/pGC-cGMP信号转导途径，使Ca2+外流，膜电位超极化［5～7］。正常生理条件下 CNP作用强于 ANP和BNP，且糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌对CNP的敏感性显著增强［5］。

糖尿病并发症发生发展中NP-NPR-B/pGC信号系统的改变起重要作用。Walther等［8］研究结果表明糖尿病小鼠心肌组织NPR-B信号增加，可导致心肌症的发生、发展。Christoffersen等［9］报道糖尿病大鼠血管组织中ANP-NPR-A信号系统和CNPNPR-B信号系统上调，并阻止高血压的发生、发展。此外，糖尿病大鼠肾组织ANP mRNA表达增强可能是为了参与适应糖尿病高糖高渗状态［10］。这些结果提示糖尿病胃动力障碍大鼠胃组织中可能发生这些信号系统的改变。

本研究观察到，CNP主要分布在胃窦平滑肌层，环行肌和纵行肌均有分布，并通过与平滑肌细胞膜上的NPR-B结合而发挥生理作用。腹腔注射STZ饲养4周的糖尿病组与正常对照组大鼠相比，胃窦平滑肌组织中CNP分布无明显差异，而NPR-B在糖尿病组大鼠胃窦平滑肌中分布明显增多。NPR-B上调可使胃窦平滑肌cGMP浓度增高，cGMP浓度增高势必增强平滑肌的舒张作用，最终将导致胃动力障碍。以上结果提示，腹腔注射STZ饲养4周的糖尿病胃动力障碍大鼠胃中CNP-NPR-B/pGC-cGMP转导系统起重要作用，其中NPR-B上调可能发挥关键作用。

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