Optiprep法分离大鼠肝星状细胞的实验研究

余盼攀，张胜初，季世强，苏龙丰，张启瑜

（温州医学院附属第一医院 肝胆外科，浙江 温州 325035）

Knook等[1]在1982年采用胶原酶、链霉蛋白酶原位循环灌注法首先成功地分离出大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC），标志着HSC研究的开始。HSC是目前肝纤维化研究的一个关键点。活化的HSC能分泌细胞外基质及多种细胞因子，在肝纤维化发生、发展及转归中扮演了重要的角色。原代HSC和体外活化的细胞株具有不同的生物学特点，原代HSC适合静止HSC的生物学特性的研究。体内绝大部分HSC是以静止状态存在，所以对原代HSC的研究更有实际意义。原代HSC的分离难度大，成功率低，建立一种合理、经济、便捷的分离方法实属必要。本研究在国内外大鼠HSC分离培养基础上采用改良的Optiprep密度梯度离心法成功分离出大鼠HSC，现介绍如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体质量500～600 g，由温州医学院动物实验中心提供，常规喂养，术前12 h禁食。

1.2 试剂及仪器 IV型胶原酶（type IV collagenase）、DNA酶I（DNaseI）、D-Hanks液均购自美国Sigma公司，Optiprep分离递质购自挪威Axis-shield公司。DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。大鼠α-SMA单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG二抗购自武汉博士德公司。倒置相差显微镜购自德国Leica公司，荧光显微镜购自日本Olympus公司，高速离心机购自美国Beckman公司。

1.3 分离用液 前灌注液：D-Hanks液500 mL+肝素钠1 mL预热至37 ℃。酶灌注液：Hanks 100 mL+IV型胶原酶0.05 g+DNA酶I 0.03 g预热至37 ℃。震荡消化液：同酶灌注液。终止消化液：DMEM培养液10 mL+胎牛血清5 mL预冷至4 ℃。细胞洗涤液：Hanks 50 mL+DNA酶I 0.02 g。离心液：10%离心液（60% Optiprep原液0.8 mL+D-Hanks液4.17 mL）；16%离心液（60% Optiprep原液1.5 mL+D-Hanks液3.5 mL）。各液体中分别加入1%青链霉素。

1.4 分离方法