冬枣多倍体育种研究进展

刘雪红，崔素芹，刘南南，徐 桂

(1.滨州学院生命科学系，山东 滨州 256603； 2.滨州学院滨州市食品安全重点实验室，山东 滨州 256603)

随着对植物多倍体的产生途径、特征及鉴定方法等方面的深入研究，诱导多倍体育种在育种领域逐渐显示出日益广阔的应用前景和发展空间。多倍体果树一般具有生长健壮、枝粗、叶厚、果大、少籽或无籽、产量高、适应性强和抗逆性强等优点，可用无性繁殖将这些优点稳定地遗传给后代，而不出现分离。因此，多倍体育种倍受果树育种研究者的青睐。

冬枣是我国枣品种中鲜食优质品种之一，果皮薄而脆，赭红色，不裂果，果肉绿白色，细嫩，汁液多，甜味浓，品质极上。研究结果表明，冬枣果肉内除含有一般枣果中的营养物质之外，还富含人体所需的19种氨基酸和维生素A、B、C、D等多种营养物质，冬枣还含有钾、钠、铁、铜等多种微量元素以及抗癌物质环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷等。

枣属植物中存在大量的天然多倍体，如毛叶枣就存在四、六、八倍体类型，赞皇大枣是目前发现的唯一的天然三倍体品种。冬枣的败育率较高，核内均为单仁，优良冬枣轻败育品种的败育率也达20%，因此冬枣多用嫁接技术进行繁殖。近年来，河北农业大学枣研究中心用秋水仙素在田间和组织培养条件下诱导枣树产生多倍体，已获得冬枣、辣椒枣等品种的四倍体变异类型。笔者从诱导材料的选择、诱导方法以及提高诱导效率的途径等方面，对我国冬枣多倍体育种研究进行了简要概述。

1 诱导材料的选择

用于组织培养的外植体材料均可以用来诱导多倍体，其中秋水仙素对于正处于分裂期的细胞诱导成功率较高。因此，大多数学者都采用愈伤组织和丛生芽进行诱导。随着诱导技术的逐渐成熟，也有用种子、离体组织成功诱导的报道。

1.1 种 子

用种子进行多倍体诱导以前多见于田间试验，但由于温度、光照条件的不确定性，对诱导结果有一定的影响。因此，现多用组织培养方法进行多倍体诱导。张蜀敏等用秋水仙素浸种法将未消毒的雪莲种子分别浸泡在含有0.01%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%秋水仙素的二甲基亚砜（2%）中共处理6 h，然后将处理的种子消毒后，接种到MS基本培养基上。但是试验结果并不理想，出现较多的嵌合体。

成熟胚的诱导效果不佳，学者们认为刚发育完整的幼胚可能效果会好些。在坐果40天左右，胚发育完整且成活率较高，将该时期的幼胚接种，离体条件下培养。幼胚接种后，主要有3种生活方式：一是形成愈伤组织，坐果后20～40天的幼胚接种后10天左右，子叶、胚轴均能出现愈伤组织，一些黄白色愈伤组织经诱导可以形成小苗，但成苗率很低；二是子叶间出现增生物，坐果后30～55天的幼胚接种后，60%～70%的幼胚子叶间会出现小叶增生的现象，形成莲座状，80天左右胚轴伸长，形成一株正常苗；三是直接由胚萌发成苗。相对成熟的胚（坐果55天后）通常是直接萌发成苗，在幼胚长出愈伤组织或新生植株后，可用来做为诱导多倍体的材料。

1.2 愈伤组织

转基因技术和多倍体诱导技术为枣的育种工作提供了新的平台，通过愈伤组织途径诱导多倍体可望实现加倍后的单细胞再分化成苗，从而可避免嵌合体的出现。而愈伤组织细胞分裂能力强，对秋水仙素较敏感，进行处理后比较容易出现多倍体。

1.2.1 冬枣花药愈伤组织利用花药或未传粉子房培养诱导多倍体，再经染色体加倍形成纯合二倍体。这是利用现代生物技术进行植物品种选育的新方法。枣的花药培养开始于20世纪90年代，最早仅在金丝小枣上有报道，但存在愈伤组织诱导率低的问题，而获得优良的愈伤组织是花药培养成功的前提。王娜、刘孟军等以我国最为著名的鲜食品种冬枣花药为试材，探讨了碳源种类、基本培养基和植物生长调节剂对花药愈伤组织诱导及增殖的影响，为枣的花药培养及育种工作奠定了基础。5～6月份选取直径0.3～0.6 cm且花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，置于4℃冰箱中预处理

1～3天后，用流水冲洗1～2 小时，转入0.1% HgCl2溶液中处理8 分钟，剥取花药接种到各种处理培养基上。研究结果表明：在MS+麦芽糖20 g/L+TDZ 1.0 mg/L的培养基中，冬枣花药愈伤组织诱导率最高，达86.8%，黄绿色松散状的愈伤组织接种到含秋水仙素的培养基可诱导形成多倍体。

1.2.2 叶片愈伤组织宁强等人在组织培养条件下，以冬枣组培苗的叶片为材料，使用TDZ和NAA结合，诱导出生长良好的愈伤组织，为冬枣叶片再生体系的建立，以及进一步的冬枣转基因和多倍体育种奠定了基础。

1.3 丛生芽

王娜、刘孟军等以冬枣和酸枣的组培苗丛芽为材料，研究了秋水仙素诱导染色体倍性变异的最佳浓度与时间组合、多倍体的特征及纯化技术。结果表明，最佳组合为50 mg/L秋水仙素处理40天，诱导冬枣和酸枣染色体加倍的频率分别达到了36.37%和26.67%。嵌合体经3～4次继代分离得到纯化，并对纯化后的变异植株进行了增殖和生根，变异株根尖染色体加倍（2n=4X=48），叶片增厚，栅栏组织、海绵组织明显发达，充分表明获得的变异株为同源四倍体。蒋洪恩等在田间人工诱导获得了冬枣、辣椒枣的四倍体和八倍体材料，但未完全纯化。

1.4 茎 段

组织培养的茎段比较嫩，易于诱导形成多倍体。王娜、刘孟军等以二倍体冬枣和酸枣的组培苗茎段为料材，以秋水仙素为诱变剂，在组织培养条件下首次获得了冬枣和酸枣的纯合四倍体植株，结果显示用0.9%秋水仙素溶液浸泡2天，诱导效果较好。

2 诱导多倍体的方法

2.1 物理诱导方法

1890～1901年，俄国学者格拉希莫夫用人工方法获得多倍体后，许多科学工作者都开展了人工诱导多倍体方法的研究。多倍体的物理诱导方法有温度激变、机械创伤、离心力、紫外线、X射线和渗透压改变等，这些方法的普遍缺陷就是诱导率低。后来由于化学诱导剂的发现，完全取代了物理诱导手段，这些方法也已不再使用。

2.2 化学药剂诱导

可诱导多倍体的化学药剂有很多，如秋水仙素、吲哚乙酸、苯及其衍生物、有机砷制剂、磺胺剂及其它植物碱、麻醉剂和生长素等，约有数百种。但使用最多、效果最好的是秋水仙素。利用秋水仙素阻碍纺锤丝的形成，使中期染色体数目加倍。用秋水仙素处理分裂旺盛的植物组织就可以获得理想的多倍体。萌发的种子和生长点是最好的诱导材料。常用的方法有以下几种：一是浸渍法，将幼苗、新梢、插条、接穗和种子等实验材料直接浸泡在秋水仙素溶液中，溶液浓度一般为0.05%～1%，为避免蒸发应加盖并在黑暗条件下处理，发芽的种子一般处理数小时至3天，插条、接穗、幼苗一般处理几天；二是涂抹法，把秋水仙素按一定浓度配成乳剂或混于羊毛脂膏内，涂抹在幼苗或枝条的顶端及花芽上；三是液滴法，常用秋水仙素的浓度为0.1%～1.0%，用脱脂棉包裹幼芽或花芽，每天滴一至数次，反复处理几日，使溶液透过表皮渗入组织内而起作用，宁强、刘孟军等用液滴法处理人为条件下在冬枣枝条上形成的愈伤组织，当秋水仙素的浓度为0.05%，处理18小时其诱变效率最高；四是注射法，用注射器将秋水仙素药液注入植株的芽或生长点，溶液浓度一般为0.4%左右；五是药剂培养基法，在材料的离体培养基中加入一定浓度的秋水仙素溶液，将外植体共培养一段时间后转到不含有秋水仙素的新鲜培养基中培养。

秋水仙素的处理浓度和时间因处理对象的不同而异，一般在0.01%～1.0%以内都是有效的，在对某一植物作初次诱导试验时，一般采用低浓度长期处理的方法。

蒋洪恩、刘孟军以二倍体冬枣、梨枣和辣椒枣的新生枣头为试材，经秋水仙素溶液诱变处理，首次获得了梨枣、冬枣和辣椒枣的八倍体材料，结果表明诱导不同品种的多倍体其最佳处理时间和浓度组合不同。梨枣的最佳处理组合为0.15%的秋水仙素处理18 小时，诱变率为50%；辣椒枣的最佳处理组合为0.1%的秋水仙素处理30 小时，诱变率为43.3%；冬枣的最佳处理组合为0.15%的秋水仙素处理18 小时，诱变率也为43.3%。

宁强、刘孟军等以二倍体冬枣和梨枣的愈伤组织为材料，用秋水仙素对愈伤组织进行诱变，首次获得了四倍体植株，结果表明，不同品种、不同秋水仙素浓度和处理时间对愈伤组织的诱变效果不同。对梨枣而言，0.05%的秋水仙素浓度处理24小时效果最好，愈伤组织变异率达到13.3%；而对冬枣来说，0.05%的秋水仙素浓度处理8 小时效果最好，愈伤组织变异率达到6.7%。

2.3 利用组织培养技术诱导多倍体

利用组织培养诱导多倍体的方法是最近十几年科研工作者采用较多的方法，该方法诱导率高，并可以克服同源多倍体育性低的缺陷，有较大的发展潜力。组织培养中使细胞染色体加倍的因素很多。据报道，不同培养基的物理状态对二倍体和多倍体的选择压力不同。培养基中加入适当浓度2,4-D及其它激素也可增加培养物上多倍体细胞的含量。但实际应用中最多的仍是秋水仙素。可将秋水仙素加入培养基中进行诱导培养，也可先用秋水仙素溶液浸泡愈伤组织，再直接接种到培养基上进行培养。

不同材料、不同处理方法对组培苗的诱变效果不同，其中丛芽的混培率最高。严仁玲等在组织培养条件下成功地将二倍体金丝小枣诱导出了四倍体植株。王娜、刘孟军等用冬枣和酸枣的二倍体组培苗为材料，以秋水仙素为诱变剂在组织培养条件下首次获得了酸枣和冬枣的纯合四倍体植株。酸枣和冬枣丛芽的最佳处理时间和浓度组合均为含50 mg/L秋水仙素的MS培养基混培4天，诱变频率分别为36.67%和26.67%。酸枣茎段最低处理时间和浓度组合为0.4%的秋水仙素溶液浸泡处理4天，诱变频率为23.33%；冬枣茎段最佳处理时间和浓度组合为0.4%秋水仙素浸泡处理2天，诱变频率为16.67%。相比之下，混培法更适合于丛芽诱变，浸泡法更适合于茎段诱变。酸枣的诱变频率明显高于冬枣。

不同材料、不同处理时间对愈伤组织的诱变效果不同。宁强等以冬枣和辣椒枣叶片为试材，在离体条件下诱导愈伤组织的形成，并利用秋水仙素对愈伤组织进行浸泡法和根培法处理。对于冬枣而言，浸泡叶片愈伤组织，秋水仙素溶液浓度0.01%处理4天，变异率最高为13.3%；混培法中，对叶片进行10天的预培养，秋水仙素浓度0.004%处理15天的变异率最高达6.7%。

3 提高组培苗诱变效率的途径

王娜、刘孟军等以冬枣组培苗丛芽和茎段为材料，以秋水仙素为诱变剂，研究了预培养、暗培养、二甲基亚砜和活性炭对诱导多倍体均有一定的影响作用。实验表明：对组培苗茎段进行4天预培养时，冬枣变异率最高，可达10%；对组培苗丛芽进行15天暗培养的处理，致死率最低、变异率最高，冬枣变异率为26.67%。

二甲基亚砜是一种诱变辅助剂，能够帮助处理材料吸收秋水仙素，但当二甲基亚砜的浓度偏高时会使材料致死率升高。活性炭可通过降低处理材料的褐化来提高诱变效率。因此，离体条件下提高诱变率的关键因素之一是抓住细胞旺盛分裂的时机进行诱变，使尽可能多的细胞加倍，以减少嵌合体出现的几率，或缩短嵌合体分离的过程。另一关键因素是降低处理材料的死亡率，使加倍的细胞尽可能多的存活下来。

4 冬枣多倍体育种现状

4.1 冬枣多倍体育种中存在的问题

冬枣枣胚败育率高，一般不是直接采用种子作为诱导材料，而是在组织培养条件下，选取茎组培苗茎尖、茎段、丛生芽为试材，通过诱导愈伤组织或直接进行多倍体诱导。如以愈伤组织作为诱导材料，则愈伤组织分化率低，不易长成幼苗。而且在多倍体诱导过程中发生加倍效应的往往是部分细胞，嵌合体的产生是难以避免的，能否对嵌合体进行及时有效地分离成为获得同源多倍体的关键因素。

4.2 多倍体中嵌合体与纯合体的比较

在诱导植物多倍体时，嵌合体是一种较为常见的现象。在嵌合体细胞的竞争过程中，细胞倍性的发展方向具有不确定性，若二倍体在嵌合体中占优势，多倍体就会在竞争中逐渐消失而使材料恢复为二倍体；相反若四倍体细胞占优势，则材料可以形成稳定的四倍体。目前解决嵌合体最好的方法是选择单细胞或单细胞起源的诱导材料，如叶片外植体愈伤组织，原生质体等。

4.3 田间诱导与离体诱导

4.3.1 从诱导方法上来看田间诱变常采用秋水仙素涂抹法，使诱变剂直接与生长点接触促使其发生变异，该方法直接作用于生长点，易产生变异；但也加重了对生长点的伤害，不适合于像冬枣这些对秋水仙素忍耐力较弱的材料。材料离体诱导一般有两种方法：秋水仙素溶液浸泡法及秋水仙素培养基混培法。混培法是比较适合于离体材料诱变的一种低浓度长时间的处理方法，且混培法比田间诱导简单得多，不需要逐株进行处理，只需将秋水仙素加入到培养基中，同时可处理大量材料，节省了人力物力。

4.3.2 从嵌合体分离来看蒋洪恩认为，田间条件下可采用修剪法对嵌合体进行纯化，但这种方法操作繁琐，而且并不能得到纯合体植株。而在离体条件下，嵌合体的分离可及时进行，且操作简单便捷。

4.3.3 从对变异株的鉴定来看 无论是田间诱变还是离体诱变，都可以通过形态观察来对诱变材料进行初期鉴定。离体条件下，还可在不影响组培苗正常生长的情况下，通过检测根尖或叶片的染色体倍性来确定材料的变异情况。

因此，利用组织培养可以同时诱导大量材料，而且培养条件容易控制，重复性好，易于进行嵌合体的分离及多倍体的鉴定，得到的四倍体植株当年就可大量扩增。这预示着利用组织培养离体诱导多倍体，有可能广泛适用于其它建立高效组织培养再生体系的各种作物，从而在染色体工程中具有广阔的应用前景。

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