香菇多糖澄清剂提取法研究

俞苏华，周福富，叶徐英，宋世杰，罗发松

(1.浙江普洛康裕天然药物有限公司，浙江 金华 321017; 2.金华职业技术学院，浙江 金华 321017;3.浙江金大康动物保健品有限公司，浙江 金华 321000; 4.浙江尖峰药业有限公司，浙江 金华 321007;5.福建梦娇兰日用化学品有限公司，福建 漳州 363400)

香菇多糖澄清剂提取法研究

俞苏华1，周福富2，叶徐英3，宋世杰4，罗发松5

(1.浙江普洛康裕天然药物有限公司，浙江 金华 321017; 2.金华职业技术学院，浙江 金华 321017;3.浙江金大康动物保健品有限公司，浙江 金华 321000; 4.浙江尖峰药业有限公司，浙江 金华 321007;5.福建梦娇兰日用化学品有限公司，福建 漳州 363400)

目的 研究香菇多糖的提取方法，提高多糖含量及提取率，扩大生产可操作性及降低生产成本。方法 采用水提、澄清除杂、高速离心和醇沉等方法提取香菇多糖。结果 与传统的水提、Sevag法、醇沉等工艺比较，澄清剂法提取香菇多糖的效果较好。结论 澄清剂法提取工艺，生产可操作性强，提高了多糖含量及产品提取率，降低了生产成本。

香菇多糖;澄清剂;Sevag提取法

香菇 Lentinus edodes(Berk.)Sing.是著名的食、药兼用菌，香菇多糖是其中的重要生物活性成分，是一种β－1，3－D葡聚糖。近年来，以吸附澄清剂作为澄清分离的方法在中药提取工艺中得到了应用，它可部分代替中药水提醇沉工艺，提高有效成分的含量，保证中药成品质量的稳定性。目前，应用于中药制剂工艺的澄清剂品种很多，如甲壳素及其衍生物、101果汁澄清剂、聚凝净、阳和1+1澄清剂、ZTC 1+1天然澄清剂等。文献报道，ZTC 1+1澄清剂用于眠尔康口服液的澄清工艺，用于生脉饮提取液的精制研究，还有用于气血双补口服液澄清研究等。由于ZTC 1+1澄清剂有多种系列，应针对不同剂型选择不同的型号。本试验选择ZTC 1+1－Ⅲ(主要针对口服剂型)澄清剂进行研究，报道如下。

1 仪器与试药

DZF6020型真空干燥箱(杭州蓝天化验仪器厂);2L型旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);DW－0.25K型调温电热碗、SHB－B88型水循环真空泵、HH－双列四孔数显水浴槽等设备均购自郑州长城科工贸公司;5 000 mL圆底烧瓶、冷凝管、烧杯、试管、玻棒、温度计、比重计等仪器。香菇干(子实体)购自武义金星食用菌有限公司，粗粉碎，待用。苯酚(天津市新精细化工开发中心)，氢氧化钠(天津市北辰方正试剂厂)，浓硫酸(太原硫酸厂劳动服务公司)，无水葡萄糖(北京化工厂)，三氯甲烷(天津市天新精化工开发中心)，正丁醇(天津市北辰方正剂厂)，均为AR;95%食用酒精(兰溪中化);碘滴定液(0.05 mol/L)、硫代硫酸钠溶液(0.1 mol/L)、淀粉指示液等均由公司化验室配制。

2 方法与结果

2.1 香菇多糖提取试验

香菇多糖提取液制备:取香菇粗粉100 g，于圆底烧瓶中，水提(加10倍量的纯化水，温控在40～45℃，5 h)，滤取水提液。重复水提1次(加8倍量水，3 h)，合并两次提取液进行减压浓缩，浓缩至比重约为1.1(25℃)，备用。

Sevag法除蛋白处理:将上述浓缩液中加入其体积1/5的三氯甲烷－正丁醇(4∶1)溶剂 ，合并于分液漏斗中，激烈振荡35 min，静置，分离水相。重复上述操作3次，得萃取液。边搅拌边加入95%酒精，至多糖液中的醇量达到70%(m/m)，充分搅匀，静置过夜，过滤沉淀物，进行真空干燥，最后得干燥物4.67 g(表面呈黑色，里呈灰黄色)。

2.2 澄清剂使用方法选择试验

选择山东药圣及天津正天成生产的ZTC 1+1－Ⅲ澄清剂进行对比研究。

澄清剂配制:按ZTC 1+1－Ⅲ澄清剂使用说明书配制澄清剂，备用。取200 g香菇粗粉，照2.1.1项下方法制备水提液，减压浓缩至比重1.02(25℃)，备用。取10支刻度试管，各量取50 mL药液，随机编号1－10，将奇数管中加入600×10－6(为每10 000 L待处理药液中加入600 kg澄清剂)澄清剂B(山东药圣)，偶数管各加入600×10－6澄清剂B(天津正天成)，于90℃水浴中处理30 min，各加入相应品种的300×10－6澄清剂A，于90℃水浴中处理20 min，过滤沉淀物，干燥，称重。澄清处理过程中均需搅拌，以下同。结果奇数管(山东药圣)中沉淀物质量分别为 1.275，1.268，1.270，1.28 g，平均1.275 g;偶数管(天津正天成)中沉淀物质量分别为1.146，1.157，1.148，1.159，1.162 g，平均 1.154 g。可见，山东药圣产澄清剂的除杂量多于天津正天成的，高出约10%。因此，选择山东药圣产的ZTC 1+1－Ⅲ澄清剂进行以下试验。

澄清剂使用方法:取浓缩液50 mL，共4份，放入试管中，置90℃水浴，各加入 600 ×10－6澄清剂 B，分别处理 20，30，40，50 min;各加入 300 × 10－6澄清剂 A，分别处理 20，30，40，50 min，过滤沉淀物，干燥称重。结果见图1。可见，澄清处理时间为30～40 min时效果较好。考虑到生产成本，确定澄清处理时间为30 min。

图1 不同沉淀时间的沉淀效果

澄清剂用量:取浓缩液50 mL，共4份，放入试管中，置90℃水浴，各加入澄清剂 B，用量分别为 200 ×10－6，400 ×10－6，600 ×10－6，800×10－6，澄清处理时间为30 min;各加入澄清剂A，用量分别为 100 ×10－6，200 ×10－6，300 ×10－6，400 ×10－6，澄清处理时间为30 min;最后过滤沉淀物，干燥称重。结果见表1。可见，澄清剂用量与产生的沉淀物质量间存在一定的比例关系，考虑生产成本，选择澄清剂用量为600×10－6澄 清 剂 B+300×10－6澄清剂 A。

表1 澄清剂用量考察结果

澄清处理温度:取浓缩液50 mL，共3份，放入试管中，分别置于75，85，95℃水浴中，各加入600×10－6澄清剂B，澄清处理时间为30 min;各加入300×10－6澄清剂A，澄清处理时间为30 min;最后过滤沉淀物，干燥称重。结果见图2。可见，澄清处理温度在85～95℃时效果较理想。结合生产实际，选择澄清处理温度为85～90℃之间，温差为±5℃，便于生产操作。

图2 不同工艺温度的沉淀效果对比

最佳澄清工艺:综合试验结果，结合生产实际，澄清剂用量为600×10－6B+300×10－6A，处理时间30 min，处理温度 85～90℃。

2.3 醇沉试验

取100 mL浓缩液，按最佳工艺澄清处理得澄清液，减压至比重约为1.1(25℃)，待用。取浓缩液50 mL，共5份，放入试管中，分别加入95%酒精至不同的醇含量，进行沉淀处理，静置过夜，过滤沉淀物，干燥称重，并测定多糖含量。结果见表2。可见，加入95%酒精至浓缩液中的醇含量为80%以上时，其多糖提取率达最大值。结合生产实际，考虑生产成本，选择80%的醇含量。

表2 醇沉试验结果

2.4 最佳澄清工艺验证试验

按确定的最佳工艺，生产3批样品，考察最佳澄清工艺。结果显示，其工艺生产中糖提取量稳定(表3)。

表3 最佳工艺验证试验结果(n=5)

2.5 含量测定及质量检查

单糖测定:取本品约0.2 g，精密称定，加热水60 mL，振摇使溶解，冷却至室温后，精密加入碘滴定液(0.05 mol/L)10 mL，摇匀，逐滴加入氢氧化钠试液4 mL，边加边振摇，密塞，放置暗处10 min，加稀硫酸4 mL，立即用硫代硫酸钠液(0.1 mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液2 mL，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL碘滴定液(0.05 mol/L)相当于9.008 mg的C6H12O6。结果批号为20071101的产品中单糖含量为7.6%。

多糖测定及标准曲线绘制:精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.1 g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。量取5 mL溶液，置100 mL量瓶中，稀释至刻度，制成贮备液。分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水稀释至 1.0 mL ，再加 3% 苯酚溶液 1.0 mL，迅速加入浓硫酸 4.5 mL，摇匀，静置至室温，以蒸馏水为空白，在490 nm波长处测定吸光度。结果批号为20071101的产品中多糖含量为45.1%，折算香菇多糖的提取率为5.92%(多糖含量以30%计)。

稳定性试验:生产的3批产品单糖、多糖含量见表3，质量符合标准要求。同时取3批产品进行加样回收、精密度试验，结果的相对标准差(RSD)均符合要求。按药典规定条件对3批产品进行加速试验，并按储藏条件进行质量稳定性考察。结果显示样品在2年有效期内稳定(表4及表5)。

表4 产品加速试验多糖含量变化情况(%)

表5 产品常温试验多糖含量变化情况(%)

3 讨论

香菇多糖的提取分离通常采取水提醇沉法，主要是将香菇(子实体)经水浸提液浸提，再经减压浓缩、Sevag法去除游离蛋白[加入0.2倍多糖溶液体积的氯仿和正丁醇(4∶1)混合液，振荡半小时进行分离，直至氯仿与水的界面无沉淀为止，且要重复处理2～3次才能有效除去多糖中的蛋白质][1－2]，得到的多糖产品纯度较低，一般为30%左右，且生产工艺较复杂，导致经济效益低。采用微波法提取香菇多糖[3]，多糖提取率高于传统热水法，且提取时间可缩短100倍，但离大规模工业生产条件尚有很大的差距，缺乏可靠的工业生产数据。酶解法提取香菇多糖[4]，采用纤维素酶、果胶酶及木瓜蛋白酶作用于香菇的细胞壁，使其破裂，多糖易从细胞内释放，提高了香菇多糖的提取率，有利于进一步的加工;还有采用中性蛋白酶将多糖从蛋白多糖中解离释放出来，从而提高了多糖的得率，且降低了多糖中蛋白质的含量。

由于所得样品是通过真空干燥后再粉碎而成，故其色泽不如喷雾干燥。通过澄清剂澄清除杂、醇沉等新工艺试制得到的香菇多糖，色泽为浅灰黄色，多糖含量为46%，单糖含量为13%，提取率为7.5%，且产品安全无毒。而旧工艺必须考虑产品的有机溶剂残留问题(采用Sevage法去除蛋白，使用氯仿和正丁醇)。优选的新工艺比提取率升高，澄清剂费用较氯仿、正丁醇低，缩短了生产周期，降低了生产成本。

[1]牛广财，朱 丹.马齿苋多糖脱蛋白方法的研究[J].食品研究与开发，2005，26(5):51－53.

[2]李知敏，王伯初.植物多糖提取液的几种脱蛋白方法的比较分析[J].重庆大学学报，2004，27(8):57－59.

[3]张海容，韩伟珍.微波法与传统热水法提取香菇多糖的比较研究[J].食品研究与开发，2005，26(5):68－71.

[4]谢红旗，杜邵龙.酶法提取香菇多糖新工艺研究[J].食用菌，2006(4):59－61.

TQ461;R282.71

A

1006－4931(2011)02－0045－02

2009－12－10;

2010－04－28)

俞苏华(1962－)，执业药师，主要从事中药生产技术研究和制药生产企业管理，(电子信箱)yush@apeloa.com。